初代培養(yǎng)或原代培養(yǎng)，可以用于：（1）從供體獲取組織后的培養(yǎng)；（2）組織和細胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大的變化，具有二倍體遺傳性狀，在供體來源充分、生物條件穩(wěn)定的情況下（年齡、性別），在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。

實驗方法原理合成培養(yǎng)基胰蛋白酶消化培養(yǎng)法，能把組織塊分散成細胞團或單個細胞，便于細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物，細胞能較快地長成單層。

 

本法尤適用于培養(yǎng)大量組織，細胞產(chǎn)量高；但用于經(jīng)常性小量培養(yǎng)工作稍顯繁瑣，無菌操作不良時且易污染。

實驗材料組織

試劑、試劑盒Hanks培養(yǎng)液胰蛋白酶

儀器、耗材吸管平皿培養(yǎng)瓶燒杯攪拌器三角燒瓶不銹鋼篩眼科剪眼科鑷計數(shù)板

實驗步驟

1.  準備

 

取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20 分鐘；

 

2.  布局

 

點燃酒精燈（或煤氣燈），安裝吸管帽（應(yīng)通過火焰）；

 

3.  處理組織

 

把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘；

 

4.  剪切

 

用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊（用手術(shù)刀割亦可），以便于消化；加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞；

 

5.  消化

 

或用恒溫水浴，或置入37 ℃溫箱消化均可，消化中每隔20 分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好（消化前瓶中需置一無菌攪棒）；消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定；

 

6.  分離

 

在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊（必要時可繼續(xù)進行消化）；低速（500~1000 轉(zhuǎn)/分）離心消化液5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再加入培養(yǎng)液）；

 

7.  計數(shù)

 

用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中；對大多數(shù)細胞來說，pH 要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說膽液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整；

 

8.  培養(yǎng)

 

置入36.5 ℃溫箱培養(yǎng)；如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需更換新塞。

 

收起 

注意事項

組織塊、胰蛋白酶、培養(yǎng)液等易受紫外線傷害的物品，在培養(yǎng)時再攜入操作野；如預(yù)先置入，需用紙張覆蓋，以免受射線影響；開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部（工作時宜挽上袖口）。

其他

常用的初代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進行培養(yǎng)。分散細胞培養(yǎng)則是將組織塊用機械法或化學(xué)法使細胞分散。如欲從胎兒或新生兒的組織分離到活性的游離細胞，經(jīng)典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和膠原酶)消化細胞間的結(jié)合物，或用金屬離子螯合劑(如EDTA)除去細胞互相粘著所依賴的Ca2＋，再經(jīng)機械輕度振蕩，使之成為單細胞。

 

參考《組織培養(yǎng)和分子細胞學(xué)技術(shù)》北京出版社

實驗材料組織

試劑、試劑盒Hanks培養(yǎng)液胰蛋白酶NaHCO3

儀器、耗材吸管培養(yǎng)瓶燒杯眼科剪眼科鑷

實驗步驟

1.  剪切

 

把組織小塊（1cm3）置入小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂液二三次以去掉表面血污，吸凈Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切成1mm3塊為止；

2.  擺布

 

用彎頭吸管吸取若干小塊，置入培養(yǎng)瓶中；用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底上，小塊相互距離以0.5 cm 為宜，每一25 ml培養(yǎng)瓶底可擺布20~30 塊；

 

3.  輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令瓶底向上；注意翻瓶時勿令組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5 ℃溫箱2 小時左右（勿超過4 小時），使小塊微干涸；

 

4.  培養(yǎng)

 

從溫臬中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46 度斜持培養(yǎng)瓶（瓶底仍向上），向瓶底角部輕輕注入培養(yǎng)液小許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊（組織小塊附著尚不牢，注意不要把組織塊沖走）；置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后，再補加培養(yǎng)液。

 

收起 

其他

一、評價

 

翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶的目的是為使組織塊微干涸，以利附和免從瓶壁流失，但時間不宜過長，超過三四小時以上可能對組織有不利影響。

 

組織塊培養(yǎng)法操作簡便，順利情況下，組織小塊貼壁培養(yǎng)后24 小時，細胞即可從小塊邊緣向四周游出，通過生長增殖，終亦可連接成片；原組織小塊可*散成細胞而消失。如組織塊過大，殘留小塊換液時棄掉或再置另瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

 

組織塊通過反復(fù)剪切可能受一定損傷，并非每塊組織都有生長能力，但只要有一部分能生長往往即可形成單層。