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技術(shù)文章

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime PCR)檢測(cè)方法

閱讀:3309          發(fā)布時(shí)間:2019-3-11

實(shí)驗(yàn)方法原理    實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
實(shí)驗(yàn)材料    細(xì)胞樣品
試劑、試劑盒    RNA提取試劑盒熒光定量PCR MixTRIZOLdNTP逆轉(zhuǎn)錄酶MMLVTaq酶DEPC水ddH2OTEMgCl2瓊脂糖溴化乙錠MOPS甲醛乙酸鈉EDTAEB溴酚蘭
儀器、耗材    離心管離心機(jī)風(fēng)光光度計(jì)電泳槽凝膠板Realtime PCR儀
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、 樣品RNA的抽提
 
1.  取凍存已裂解的細(xì)胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。
 
2.  兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的,蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
 
3.  RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
 
4.  RNA清洗 移去上清液,每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀?;靹蚝?,4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
 
5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
 
6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí),先加入無RNA酶的水4 0ul用槍反復(fù)吹打幾次,使其*溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
 
二、 RNA質(zhì)量檢測(cè)
 
1.  紫外吸收法測(cè)定
 
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。
 
 (1)濃度測(cè)定
 
A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為:A260 x 稀釋倍數(shù) x 40 ug/ml。具體計(jì)算如下:
 
RNA溶于40 ul DEPC水中,取5 ul,1:100稀釋至495 ul的TE中,測(cè)得A260 = 0.21
 
RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
 
取5 ul用來測(cè)量以后,剩余樣品RNA為35 ul,剩余RNA總量為:
 
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
 
(2)純度檢測(cè)
 
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。
 
2.  變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定
 
(1)制膠
 
1 g瓊脂糖溶于72 ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 。

10x MOPS電泳緩沖液
濃度  成分
0.4 M  MOPS,pH 7.0
0.1 M  乙酸鈉
0.01 M  EDTA
 
灌制凝膠板,預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內(nèi),加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。
 
(2)準(zhǔn)備RNA樣品
 
取3 ugRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
 
(3)電泳
 
上樣前凝膠須預(yù)電泳5 min,隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h,電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3 cm。
 
(4)紫外透射光下觀察并拍照
 
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì),可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染,將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn),即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶,RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。
 
三、樣品cDNA合成
 
1.  反應(yīng)體系
 
序號(hào)          反應(yīng)物           劑量
1          逆轉(zhuǎn)錄buffer       2 ul
2         上游引物              0.2 ul
3         下游引物              0.2 ul
4          dNTP                   0.1 ul
5       逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV     0.5 ul
6         DEPC水              5 ul
7          RNA模版            2 ul
8           總體積               10 ul
 
輕彈管底將溶液混合,6 000 rpm短暫離心。
 
2.  混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘,取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致,然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 ul,37℃水浴60分鐘。
 
3.  取出后立即95℃干浴3分鐘,得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液,保存于-80℃待用。
 
四、 梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因(β-actin)實(shí)時(shí)定量PCR
 
1.  β-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011,反應(yīng)前取3 μl按10倍稀釋(加水27 ul并充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。
 
2.  反應(yīng)體系如下:
 
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
 
序號(hào)           反應(yīng)物                           劑量
1       SYBR Green 1 染料             10 ul
2       陽(yáng)性模板上游引物F              0.5 ul
3      陽(yáng)性模板下游引物R              0.5 ul
4                 dNTP                            0.5 ul
5                 Taq酶                           1 ul
6           陽(yáng)性模板DNA                    5 ul
7              ddH2O                            32.5 ul
8               總體積                            50 ul
 
輕彈管底將溶液混合,6 000 rpm短暫離心。
 
3.  管家基因反應(yīng)體系:
 
序號(hào)            反應(yīng)物                                劑量
1      SYBR Green 1 染料                   10 ul
2      內(nèi)參照上游引物F                         0.5 ul
3     內(nèi)參照下游引物R                         0.5 ul
4               dNTP                                    0.5 ul
5               Taq酶                                   1 ul
6      待測(cè)樣品cDNA                             5 ul
7              ddH2O                                  32.5 ul
8             總體積                                    50 ul

輕彈管底將溶液混合, 6000 rpm短暫離心。
 
3.  制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī),反應(yīng)條件為:93℃ 2分鐘,然后93℃ 1分鐘,55℃ 2分鐘,共40個(gè)循環(huán)。
 
五、 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板
 
1.  針對(duì)每一需要測(cè)量的基因,選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
 
2.  反應(yīng)體系
 
序號(hào)                     反應(yīng)物                        劑量
1                     10× PCR緩沖液            2.5 ul
2                           MgCl2 溶液              1.5 ul
3                           上游引物F                 0.5 ul
4                           下游引物R                0.5 ul
5                            dNTP混合液            3 ul
6                            Taq聚合酶               1 ul
7                             cDNA                       1 ul
8                    加水至總體積為               25 ul
 
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
 
35個(gè)PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72?C延伸5分鐘。
 
(3)PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。
 
(4)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。
 
六、 待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR

1.  所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。
 
2.  體系配置如下:
 
序號(hào)             反應(yīng)物                                劑量
1            SYBR Green 1 染料               10 ul
2                上游引物                               1 ul
3                下游引物                               1 ul
4                  dNTP                                   1 ul
5              Taq聚合酶                               2 ul
6             待測(cè)樣品cDNA                        5 ul
7                   ddH2O                              30 ul
8                   總體積                               50 ul
 
輕彈管底將溶液混合,6 000 rpm短暫離心。
 
(3)將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:93℃ 2分鐘預(yù)變性,然后按93℃ 1分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘,共40做個(gè)循環(huán),后72℃7分鐘延伸。
 
七、 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表
 
引物設(shè)計(jì)軟件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補(bǔ);引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu);引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。
 
八、電泳
 
各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView染色,檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。
收起 
注意事項(xiàng)    
1.熒光閾值:在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量標(biāo)準(zhǔn))。熒光閾值可設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,但實(shí)際應(yīng)用要結(jié)合擴(kuò)增效率,線性回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮。

2.Ct值:在PCR擴(kuò)增過程中,擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號(hào))到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。Ct值具有*的重復(fù)性。
其他    
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:

1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性*,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。

2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確,重現(xiàn)性、的定量方法,已得到*的*,廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

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