Annexin-V-FITC 單染法

實驗方法原理細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細胞的生命現(xiàn)象之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細胞凋亡過度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關(guān)。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細胞，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

實驗材料Annexin V-FITC

試劑、試劑盒標(biāo)記緩沖液PBS去離子水冰塊

儀器、耗材移液器吸頭微量離心管可調(diào)速離心機載玻片蓋玻片流式細胞儀或熒光顯微鏡

實驗步驟

1.  凋亡細胞的制備

 

小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺，分離胸腺細胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測細胞的濃度為2×106 /ml，備用。

 

2.  200 μl細胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。

 

3.  重復(fù)步驟2兩次。

 

4.  將細胞重懸于200 μl 標(biāo)記緩沖液。

 

5.  加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 分鐘或4 ℃反應(yīng)30 分鐘。

 

6.  加入300 μl標(biāo)記緩沖液，立即上機（流式細胞儀）檢測。

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注意事項

1.  整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4 ℃下操作。

 

2.  反應(yīng)完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態(tài)的過程，反應(yīng)一小時后熒光強度就開始衰變。

 

3.  Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時要注意避光。

 

 

 

 

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其他

一、實驗結(jié)果

 

用熒光顯微鏡觀察，凋亡細胞細胞膜上可見黃綠色光環(huán)。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是調(diào)亡所*的，也可發(fā)生在細胞壞死中。以FITC標(biāo)記的Annexin V, 可以同時結(jié)合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式細胞儀分析可檢測凋亡細胞的百分率。