低溫運(yùn)輸，-20℃保存
核桃源性成分染料法熒光定量PCR 試劑盒
Walnut-Derived Material SYBR PCR Kit
使用手冊V1.0
產(chǎn)品及特點(diǎn)本試劑盒可用于檢測食品或其他材料中是否有核桃的成分?，F(xiàn)代食品加工工藝極大
改變了食材原有的味道、氣味、色澤、紋理和質(zhì)地等特性，因此傳統(tǒng)的感官鑒別技術(shù)已
經(jīng)無法對食材的真?zhèn)芜M(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。同時部分食材還有致敏性，因此基于基因檢測的
快速靈敏的食材來源檢測技術(shù)將對食品監(jiān)管和安全提供重要的保障。本產(chǎn)品就是為滿足
這一需求根據(jù)PCR 原理開發(fā)的產(chǎn)品，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA。
2. 根據(jù)核桃保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，能專一性地檢測出樣品中的核桃成分，但不能檢測其
他非核桃成分。
3. 熒光定量PCR 檢測，比常規(guī)PCR 更加靈敏。
4. 快速，整個檢測過程（按一個樣品計(jì)）所需時間僅為2.0 小時。
5. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。
6. 提供陽性標(biāo)準(zhǔn)品，便于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
7. 對混合樣品中核桃成分的檢測下限為0.01%，對樣品中核桃成分的核酸檢測下限
為0.1ng/μL。
8. 本只能用于科研，足夠50 次20uL 體系的熒光定量PCR。
規(guī)格及成分成分編號十孔盒包裝（去紙托）
2×qPCR MagicMix 90408 0.5 mL（棕色）
熒光PCR 模板稀釋液180701 1 mL（黃蓋）
核桃源性成分PCR 引物混合液14-507yw 100 uL（白蓋）
核桃源性成分PCR 陽性對照14-507pc 50 uL（黃蓋）
DNA 釋放劑試用裝130982 50 次（成分見下）
免DNA 提取試劑溶液A 成分一130982a 50 uL（白蓋）
免DNA 提取試劑溶液A 成分二130982 100uL（綠蓋）
免DNA 提取試劑溶液B 130982c 400 uL（紅蓋）
使用手冊13-510sc 1 份
運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。使用本試劑盒提供的陽性對照時，由于其濃度較
高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。專門的區(qū)域操作。
自備試劑DNA 模板
使用方法一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7 拷貝/μL 這6 個10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)
準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本
試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣
品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA 片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6 個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在7 號管中加入5 μL 陽性對照（濃度為1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分
震蕩1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在6 號管中加入5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，
充分震蕩1 分鐘，得1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在5 號管中加入5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，
充分震蕩1 分鐘，得1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8. 如果有N 個樣品，則需要進(jìn)行N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對
照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的DNA 釋放劑試
用裝。則按下面步驟操作：
9. 配制溶液A 工作液。以配制1mL 工作液（足夠10 個樣品）為例：在一干凈塑料
管中加入10uL 溶液A 成分一，20uL 溶液A 成分二和970uL 超純水，充分混合
均勻即可。溶液A 工作液可室溫放置，但在一周內(nèi)用完，不要長期放置。一
次檢測一個樣品需要100uL 溶液A 工作液，1mL 工作液足夠10 個樣品。如果待
測樣品數(shù)量為其他數(shù)字，配制的溶液A 工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整。
10. 在標(biāo)記好的N+2 個離心管中，加入1-5mg 固體樣品（半粒芝麻大?。┗?uL 液
體樣品待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入5uL 陽性對照，在樣品制備陰性對
照中加入5uL 水。
11. 在每個管中加入100 uL 溶液A 工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣
品則震蕩混勻。
12. 95℃保溫10 分鐘。
13. 待冷卻到常溫后加入10uL 溶液B 并混勻得DNA 釋放液。每個樣品得到的DNA
釋放液足夠進(jìn)行50-100 次PCR。
三、設(shè)置qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
14. 如果只做1 次重復(fù)，則標(biāo)記N+9 個PCR 管，其中N+2 個用于上步得到的N+2 個
樣品，1 個用于PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（也充當(dāng)PCR 陽性對照）。
如果做2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2 或3 倍。
成分
樣品管
N+2 個
PCR 陰性
對照管
標(biāo)準(zhǔn)曲線
樣品管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix
（棕色管）
各10 μL 10 μL 各10 μL
核桃源性成分PCR 引物
混合液（白蓋）
各2 μL 2 μL 各2 μL
自備10×ROX (見注) 各2 μL 2 μL 各2 μL
待測樣品DNA 模板各6 μL 不加不加
第7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣
品稀釋液（2-7 號）
不加不加
各6μL（2 號樣到
2 號管，3 號樣到3
號管…）
過程溫度時間
預(yù)變性94℃ 5 min
PCR 反應(yīng)
（35 個循環(huán)）
94℃ 0.5 min
53℃ 0.5 min（采集SYBR 通道的
熒光信號）
72℃ 0.5 min
后延伸72℃ 10 min
15. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢
后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
注:僅ABI7500、7700 和7900 儀器需要使用ROX 作為對照，其他熒光PCR 儀
器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene
3000、RotorGene 6000 和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。
16. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行qPCR（具體PCR 參數(shù)可以根據(jù)qPCR 儀器的
不同而自行優(yōu)化）。
四、qPCR 反應(yīng)參數(shù)
五、數(shù)據(jù)處理
17. 以陽性對照濃度的log 值為橫軸，以Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品
的Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
六、電泳檢測
18. 如果有必要電泳確認(rèn)，可取10-20 uL PCR 產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物的
大小為91bp。開蓋電泳驗(yàn)證容易污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境，強(qiáng)烈不建議采用此方法。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品核桃源性成分可視化LAMP 檢測試劑盒
20190225dx