沙門(mén)氏菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒
使用手冊(cè)V1.0
Salmonella qPCR Kit
CAT#:14-32800
低溫運(yùn)輸，-20℃保存
產(chǎn)品及特點(diǎn)沙門(mén)氏菌（Salmonella）引起的中毒病例在世界各地的食物中毒病例中所
占數(shù)量比例非常高。在我國(guó)，70-80%細(xì)菌性食物中毒事件是由沙門(mén)氏菌引起的， 沙
門(mén)氏菌的檢測(cè)已成為食品質(zhì)量安全監(jiān)控的必檢衛(wèi)生指標(biāo)。本試劑盒就是針對(duì)沙門(mén)氏
菌腸毒素stn 基因設(shè)計(jì)特異性引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)開(kāi)發(fā)的沙門(mén)氏菌
檢測(cè)試劑盒，它通過(guò)熒光染料實(shí)時(shí)顯示樣品模板DNA 的量，并通過(guò)坐標(biāo)曲線(xiàn)表示
出來(lái)，結(jié)果直觀(guān)準(zhǔn)確。它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供樣品模板，操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確快速。
2. 熒光定量PCR 檢測(cè)，反應(yīng)特異性強(qiáng)。
3. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
規(guī)格及成分成分編號(hào)50 次塑料袋包裝
2×qPCR Mix 90408 1.0 mL
stn 專(zhuān)一性引物對(duì)yw13891390 100 μL
stn 陽(yáng)性對(duì)照
（1.5×10E9 拷貝/μL）
yw13911392 10 μL
超純水100935 1 mL
使用手冊(cè)1 份
運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限一年。
自備試劑樣品等
使用方法一、樣品DNA 的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA。注意：DNA 純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的
關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR 再靈敏也不能提高整體檢
測(cè)靈敏度。
二、制備stn 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（以10-10E6 這6 個(gè)10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃
度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試
劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活
體病毒做陽(yáng)性對(duì)照，只提供沒(méi)有傳染性的、可以直接使用的DNA 片段作為陽(yáng)性
對(duì)照。
1. 標(biāo)記6 個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2和1 號(hào)。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照用TE 緩沖液或超純水10 倍梯度稀釋到
10E7 拷貝/μL（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7
拷貝/μL，建議每次稀釋10 倍，梯度稀釋至10E7 拷貝/μL）。
4. 在6 號(hào)管中加入5 μL 10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震
蕩1 分鐘，得10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。
5. 換槍頭，從6 號(hào)管中取5 μL 溶液到5 號(hào)管中，充分震蕩1 分鐘，得10E5
拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。
6. 換槍頭，從5 號(hào)管中取5 μL 溶液到4 號(hào)管中，重復(fù)上面的操作直到得到6
個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。
7. NC 管中不加任何陽(yáng)性對(duì)照。
8. 從1-6 號(hào)管中分別取5 μL 和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量PCR（見(jiàn)下步），每個(gè)
樣品做3 次重復(fù)。PCR 后得到每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照稀釋樣品的熒光PCR Ct 值，
并以之為縱軸，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
三、PCR 檢測(cè)（20 μL 體系）
1. 在PCR 管中加入下列成分（待測(cè)樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次）：
注:僅ABI7500、7700 和7900 儀器需要使用ROX 作為對(duì)照，其他熒光PCR
儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、
RotorGene 3000、RotorGene 6000 和LightCycler480）不需要使用ROX。
2. 建議PCR 反應(yīng)參數(shù)（具體PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）
過(guò)程溫度時(shí)間
預(yù)變性93℃ 5 min
PCR 反應(yīng)
（40 個(gè)循環(huán)）
93℃ 35 s
55℃ 45 s
成分樣品陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照
2×qPCR Mix 10 μL 10 μL 10 μL
待測(cè)樣品DNA 模板1-5 μL 無(wú)無(wú)
stn 陽(yáng)性對(duì)照無(wú)無(wú)
5 uL（每個(gè)管加一個(gè)稀釋度的對(duì)照）
自備10×ROX (見(jiàn)注) 2 μL 2 μL 2 μL
stn 專(zhuān)一性引物對(duì)2 μL 2 μL 2 μL
補(bǔ)水到20 μL
3. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合
DNA 時(shí)，大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA 時(shí)的大吸收光譜在500 nm，
大發(fā)射光譜在530 nm。
四、數(shù)據(jù)處理
以stn 陽(yáng)性對(duì)照濃度的log 值為橫軸，以Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。再
以待測(cè)樣品濃度的log 為橫軸，以Ct 值為縱軸，通過(guò)待測(cè)樣品的Ct 值計(jì)算出
樣品DNA 的濃度。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品鸚鵡熱衣原體熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒（CAT#:11-3780）
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