真菌/酵母細(xì)胞β1，3- D-葡聚糖合成酶活性定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
真菌/酵母細(xì)胞β1，3- D-葡聚糖合成酶活性定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過β1，3- D-葡聚糖合成酶反應(yīng)系統(tǒng)中尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖底物聚合成葡聚糖，與熒光染料結(jié)合產(chǎn)生熒光峰值的變化，來測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種真菌或酵母細(xì)胞株裂解懸液中β1，3- D-葡聚糖合成酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，具有高通量特點(diǎn)。
技術(shù)背景
真菌/酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)具有豐富的糖蛋白外層和碳水化合物內(nèi)層，包括（1,3）-β-D，（1,6）-β-D和（1,3）-α-D-葡聚糖（glucan）。其中（1,3）-β-D為主要元素。1,3-β-D-葡聚糖合成酶（1,3-β-D-glucan synthase；GS；EC.2.4.1.34），又稱為尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖：1,3-β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucose：1,3-β-glucosyl transferase），催化以尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖（UDP-glucose）為底物，通過1,3-β鏈接聚合為葡聚糖的反應(yīng)，構(gòu)成真菌/酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中主要碳水化合物成分1,3-β-D-葡聚糖，為細(xì)胞生長(zhǎng)所必需。1,3-β-D-葡聚糖合成酶具有兩種結(jié)構(gòu)體：1個(gè)調(diào)節(jié)亞體，GTPase Rho1p和4個(gè)催化亞體，Bgs1p－4p或Fksp。（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶成為抗真菌藥物，例如卡泊芬凈（caspofungi）等的靶標(biāo)?；诘孜颱DP-glucose在葡聚糖合成酶的催化下，聚合成（1,3）-β-D－葡聚糖產(chǎn)物，與苯胺藍(lán)（Aniline blue；4,4-（carbonyl-bis（benzene-4,1- diyl）-bis-（imino）-bis-benzenesulfonic acid）反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)合物，呈現(xiàn)熒光峰值的變化（激發(fā)波長(zhǎng)400nm，散發(fā)波長(zhǎng)460nm），由此定量測(cè)定β1，3- D-葡聚糖合成酶的活性。
產(chǎn)品內(nèi)容
裂解液（Reagent A） 毫升
強(qiáng)化液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
底物液（Reagent D） 微升
終止液（Reagent E） 微升
反應(yīng)液（Reagent F） 毫升
稀釋液（Reagent G） 微升
標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent F）避免光照；終止液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月
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用戶自備
15 毫升錐形離心管：用于真菌/酵母細(xì)胞收集的容器
1.5 毫升離心管：用于真菌/酵母細(xì)胞裂解操作或反應(yīng)液配制的容器
臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀真菌/酵母細(xì)胞
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于真菌/酵母細(xì)胞裂解懸液澄清
超速離心機(jī)：用于微粒體樣品制備
恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育
比色皿或酶標(biāo)板：用于染色后熒光檢測(cè)的容器
熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣品準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好10 毫升待測(cè)的新鮮真菌/酵母細(xì)胞（OD600＝0.4 至0.8，即1 至2 X 107細(xì)胞/毫升）
2． 移入到預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
3． 置于冰槽里5 分鐘
4． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為3000g
5． 小心抽去上清液
6． 加入xx 微升裂解液（ Reagent A），充分混勻
7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 毫升離心管
8． 加入xx 微升強(qiáng)化液（Reagent B）（注意：參見注意事項(xiàng)3）
9． 強(qiáng)力渦旋震蕩15 秒
10．置于冰槽里1 分鐘
11．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9 至10 五次
12．加入xx 微升裂解液（Reagent A），充分混勻
13．放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管
15．（選擇步驟）如果使用微粒體樣品，放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60 分鐘，速度為100000g
16．（選擇步驟）小心移取500 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管
17．移取 5 微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－
30030.1 ）
18．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測(cè)定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀（溫度為25℃）：激發(fā)波長(zhǎng)400nm，散發(fā)波長(zhǎng)460nm，并置零
3． 準(zhǔn)備好5 個(gè)1.5 毫升離心管，標(biāo)記為1 至5 號(hào)管
4． 分別加入xx 微升稀釋液（Reagent G）到2 至5 號(hào)管
5． 移取xx 微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1 號(hào)管，混勻
6． 小心移取xx 微升1 號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2 號(hào)管，混勻
7． 小心移取xx 微升2 號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3 號(hào)管，混勻
2
8． 小心移取20 微升3 號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4 號(hào)管，混勻
9． 將1 至5 號(hào)管置于室溫下備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
管號(hào) 稀釋液（Reagent G） 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） 標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖濃度
1 ―― 微升 納摩爾/升
2 微升 微升1 號(hào)管 納摩爾/升
3 微升 微升2 號(hào)管 納摩爾/升
4 微升 微升3 號(hào)管 納摩爾/升
5 微升 0 0
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到1.5 毫升離心管
2． 加入5 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
3． 加入xx 微升終止液（Reagent E）
4． 放進(jìn)80℃恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽孵育30 分鐘，避免干枯
5． 加入xx 微升反應(yīng)液（Reagent F），混勻
6． 放進(jìn)50℃恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽孵育30 分鐘，避免光照
7． 室溫下孵育30 分鐘，避免光照
8． 轉(zhuǎn)移到比色皿或酶標(biāo)板
9． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)
10．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1 至9 四次
11．構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為相對(duì)熒光單位；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖濃度（納摩爾/升）
四、 樣品測(cè)定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到1.5 毫升離心管
2． 加入xx 微升底物液（Reagent D ）
3． 加入xx 微升上述制備的待測(cè)樣品（20 微克微粒體蛋白或100 微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白），混勻（注意：
樣品須清澈）
4． 室溫下（25℃）孵育30 分鐘
5． 加入xx 微升終止液（Reagent E）
6． 放進(jìn)80℃恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽孵育30 分鐘，避免干枯
7． 加入xx 微升反應(yīng)液（Reagent F），混勻
8． 放進(jìn)50℃恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽孵育30 分鐘，避免光照
9． 室溫下孵育30 分鐘，避免光照
10．轉(zhuǎn)移到比色皿或酶標(biāo)板
11．即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得樣品相對(duì)熒光讀數(shù)
12．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)葡聚糖濃度
五、 計(jì)算樣品活性
[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)葡聚糖濃度（納摩爾/升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷ X xx（分鐘）＝皮摩爾/毫升/分鐘
÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/分鐘
3
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為25 次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)樣
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 強(qiáng)化液（Reagent B）為固體狀，移取方法為：使用1 毫升槍頭，將部分剪去；或使用
0.5 毫升PCR 管的蓋子內(nèi)圈盛滿；或秤重0.1 克
4． 終止液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全
5． 建議測(cè)定細(xì)胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計(jì)算活性單位之需；建議使用－Bradford 蛋白質(zhì)濃
度定量檢測(cè)試劑盒（30030.1 ）
6． 熒光測(cè)定后，比色皿須清洗*
7． 酶活性單位濃度定義：在28℃室溫下，pH 7.8 的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）合成1 微
摩爾的葡聚糖
8． 待測(cè)樣本為微粒體，其蛋白濃度為20 微克/5 微升；待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為100 至
200 微克/5 微升（本公司提供 GENMED Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1 ）
9． 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
10．本公司提供系列真菌/酵母細(xì)胞酶學(xué)相關(guān)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感