貼壁細(xì)胞細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，繼續(xù)生長(zhǎng)的空間不足，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成份也消耗較多，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增。

對(duì)于貼壁不太緊的細(xì)胞如293，可以直接吹散后分瓶。而對(duì)于貼壁較緊的細(xì)胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般過(guò)程為 （以下操作均按無(wú)菌操作的要求進(jìn)行）：

將長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去；

加入0.25%胰酶溶液，視細(xì)胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多，以使充分浸潤(rùn)；

一般消化時(shí)間約為1至3分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)見(jiàn)到出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去胰酶溶液，并加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化；

視實(shí)驗(yàn)要求分入多瓶繼續(xù)培養(yǎng)，一般為一傳二到一傳四的比例。

這里，胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵：消化過(guò)度則對(duì)細(xì)胞的活性損傷較大，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。

影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或4℃保存時(shí)間長(zhǎng)短、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時(shí)間及溫度等）、消化時(shí)的溫度（氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等。以筆者的經(jīng)驗(yàn)，以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好，但對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不太充分的實(shí)驗(yàn)者而言是較難判斷掌握的。 下面將細(xì)胞生長(zhǎng)及不同消化程度的光學(xué)顯微鏡照片列出以供參考。

所用細(xì)胞為CHO貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)基為含10%小牛血清的DMEM-F12，倒置顯微鏡10X40，數(shù)碼相機(jī)300萬(wàn)像素。

取細(xì)胞凍存管一支，于40°C水中速融；25ml細(xì)胞方瓶中加入含10%COSMIC小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基10ml，將凍存管中細(xì)胞全部洗入瓶中，置37°C 2.5%二氧化碳孵箱中靜置培養(yǎng)。4小時(shí)后倒去全部培養(yǎng)基以去除凍存液，更換10ml培養(yǎng)基，同上靜置培養(yǎng)。