實(shí)驗(yàn)方法原理    SD胎鼠腦皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)7 d ，微量移液器塑料滴頭于培養(yǎng)孔內(nèi)機(jī)械性劃割培養(yǎng)之神經(jīng)元，依劃割程度不同分為輕、中、重3組，對(duì)照組除不進(jìn)行機(jī)械性劃割，其余處理同損傷組，傷后不同時(shí)間點(diǎn)（10，30 min ， 1，3，6，12，24 h）檢測(cè)細(xì)胞存活率及培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)含量。
實(shí)驗(yàn)材料    SD大鼠
試劑、試劑盒    硼酸硼砂緩沖液胰酶-EDTA 消化液D-Hanks’
儀器、耗材    眼科剪滴管離心機(jī)培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、實(shí)驗(yàn)步驟
 
1. 孕16 d SD 大鼠經(jīng)麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預(yù)冷的D-Hanks’平衡鹽液中。
 
2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內(nèi)消化20 min，中間搖晃一次。
 
3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的培養(yǎng)液(DMEM＋10%FBS)的離心管內(nèi)終止消化液作用5 min。
 
4. 用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的 DMEM＋10%FBS 的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟 2～3 次。
 
5. 將所收集的上清經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾。
 
6. 過濾后的細(xì)胞懸液于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成單細(xì)胞懸液。
 
7. 細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度按1.5x105/cm2  種入6 孔板內(nèi)，放入CO2 孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1x10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量換液。以后每隔 3 天半量換液一次。
收起 
注意事項(xiàng)    
1. 上面的步驟是傳統(tǒng)方法。有許多地方可以進(jìn)行改動(dòng)：如消化時(shí)可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右，也可用 DNA 酶進(jìn)行消化，有人還直接進(jìn)行吹打，都可行。
 
2. 上面雖然時(shí)大鼠皮層神經(jīng)元，但是同樣適用于小鼠，但是應(yīng)該選擇孕13 d 左右的小鼠。
 
3. 神經(jīng)元是一種比較難培養(yǎng)的細(xì)胞，因此在接種時(shí)細(xì)胞的密度一定要夠。
 
4. 在玻片上培養(yǎng)神經(jīng)元時(shí)，一定要注意玻片的來源和處理方法，這個(gè)非常重要，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響 是很大的。如果您現(xiàn)在在玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)元生長(zhǎng)情況還不錯(cuò)的話，那么您在以后的培養(yǎng)中還是用同 一來源(廠家)的玻片。
 
5. 如果有B27 和neurobasal 培養(yǎng)基，那么就方便了(不用加 AraC):
 
(1)把細(xì)胞懸液用(DMEM＋20%FBS)懸浮，種到培養(yǎng)皿上6－12 h 后，全量換成 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d 半量換液。
 
(2)把細(xì)胞懸液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基懸浮接種。
 
(3)可以用新生1 d 內(nèi)的胎鼠皮層直接培養(yǎng)。
酶消化法
實(shí)驗(yàn)材料    小鼠
試劑、試劑盒    酒精解剖液胰蛋白酶DMEM F12B27阿糖胞苷培養(yǎng)液
儀器、耗材    培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)步驟

1.  于無菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1 min，解剖出完整鼠腦。

2.  預(yù)冷解剖液中分離去除軟膜、血管、取大腦皮質(zhì)漂洗，用眼科剪將皮質(zhì)反復(fù)剪切成碎塊。

3.  移入培養(yǎng)皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37℃培養(yǎng)箱中消化30 min。

4.  將皮層組織碎塊移入離心管，棄去剩余消化液，用接種液洗3次，每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底，棄去上清液。

5.  后再用接種液1 ml混懸，反復(fù)吹打（巴氏吸管）混懸液中組織塊，力度適中，至渾濁后將上清液移入培養(yǎng)瓶待用。

6.  加入1ml接種液后再次吹打，如此反復(fù)3-4次，組織塊逐漸消化后，棄去終殘塊。

7.  收集含單細(xì)胞懸液的上清液約4-5 ml于培養(yǎng)瓶中，以接種液重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞記數(shù)；接種1x107個(gè)細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中。

8.  培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后，換全培養(yǎng)液（DMEM/F12+2%B27）培養(yǎng)3d，觀察神經(jīng)元生長(zhǎng)狀況。

9.  換用阿糖胞苷培養(yǎng)液、  每隔3d換全培養(yǎng)液1次，每次換半液。

二、神經(jīng)元免疫化學(xué)鑒定

1.  4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌3次。

2.  加入無水甲醇:30%雙氧水（5:1）處理30 min，PBS洗滌3次。

3.  加入5%羊血清封閉20 min，棄去多余液體。

4.  加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神經(jīng)元特異性烯醇化酶），培養(yǎng)箱中孵育2-4 h，PBS洗滌3次。

6.  加入DAPI染液（1:40），室溫放置5-10 min；PBS洗滌3次。

7.  熒光顯微鏡觀察。 

三、結(jié)果      

圖1： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖

圖2： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)1d后

圖3： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)2d后

圖4： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)3d后

圖5： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)4d后

圖6： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)5d后

圖7： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)6d后

圖8：第7d免疫鑒定圖