用 10 對不同的引物擴(kuò)增約 5kb 的片段，模板 DNA 是一樣的，反應(yīng)體系是 50ul, 對照中未加模板，含有單一引物。對于循環(huán)數(shù)較多（25?40) 的反應(yīng)，一般應(yīng)設(shè)置一個(gè)沒有模板或單引物對照。本實(shí)驗(yàn)來源于 PCR 實(shí)驗(yàn)指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。

試劑、試劑盒    甜菜堿PCR 反應(yīng)緩沖液TEN+BSA酶和酶緩沖液核酸及引物
儀器、耗材    PCR 儀
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
滅菌水配制的下列試劑，儲(chǔ)存在的溫度條件下。
(1) 5mol/L 甜菜堿（SigmaB-2629 或 SigmaB-2754)
過濾滅菌，室溫保存。
(2) 10XKLA PCR 反應(yīng)緩沖液，pH9.2
500 mmol/LTris 堿 (Sigma;Trizma 堿)
169 mmol/L(NH)4SO4
25 mmol/LMgCl2
1%Tween20
不 用調(diào)節(jié)，pH 約 9.2(大片段擴(kuò)增），對于一些質(zhì)粒，如 col El,pH7.9 比較適宜（見第 29章); 用 2mol/L 的 HCl 10XKLA 到 pH7.9, 不要將 pH 計(jì)直接插入到緩沖液中，以免外界 DNA 污染，可以取一小滴檢測。要避免 10X 緩沖液結(jié)冰，過濾滅菌后儲(chǔ)存于 4°C(如果緩沖液變得渾濁，用前搖勻仍可使用)。對于 Kletaq LA,Mg2+濃度很重要。在全長 Taq 酶擴(kuò)增體系中（10XTLA),MgCl2 只有7.5 mmol/L。
(3) TEN+BSA
10 mmol/L Tris-HCl(pH7.9)
10 mmol/L NaCl
0.lmmol/L  EDTA
100ug/ml  BSA
-20°C保存。
一般用 TEN+BSA 稀釋模扳 DNA 至 10ng/ml(或低于），這樣可以增加重復(fù)性，特別是凍存后。
2. 酶和酶緩沖液
Klentaq LA 為 50?55U/ul(推薦的酶濃度，根據(jù)復(fù)制子的長度而不同；見 6.1 疑難解答②)。
3. 核酸及引物
(1)10/40dNTP 混合物
每種 dNTP10 mmol/L
40 mmol/LMgCl2
每 種 dNTP 可以從 Pharmacia Biotech 購得干粉，溶解成 l0mmol/L, 儲(chǔ)存于-80°C。一般以 500/ul 分裝dNTP 混合液儲(chǔ)存于一 80°C, 如果常用則儲(chǔ)存于-20°C。用 dNTP 混合液比購買 dNTP(100 mmol/L) 更有利于獲得高產(chǎn) PCR 產(chǎn)物。作者沒有用新購的 dUTPase 作比較，因此用 dUTP 可能有點(diǎn)問題。
(2)10umol/L 引物
將引物稀釋到 l0pmol/L,50ul 反應(yīng)體系中加入 1ul，-20°C 保存.
4. 設(shè)備
PCR 儀。
二、方法
1.冰上加入下列試劑。
10XKLA,pH9.2，有些質(zhì)粒用 pH7.9                                                60ul
10/40dNTP 混合物，終濃度為每種 l00umol/L                                6ul
5mol/L 甜菜堿（終濃度 1.2mol/L), 部分質(zhì)粒終濃度可達(dá) 2mol/L    156ul
H20                                                                                                 345ul
KlentaqLA(如果靶 DNA 小于 2kb，加 lul 即可）                             3ul
混勻
2.取出 48ul, 加入 2ul 引物，作為對照。
3.剩余的溶液中加入濃度為 l0ng/ul 基因組 DNA, 混勻。
4.每管取 48ul。
5.每管中加入上下游引物各 1ul, 也可以將上下游引物混在一起，加入 2ul。不要擔(dān)心混合不均勻，因?yàn)?PCR 擴(kuò)增過程中的對流足以將其混勻。
6.編制 PCR 擴(kuò)增程序時(shí)，每一個(gè)循環(huán)的加熱時(shí)間約 5?10s, 有的 PCR 儀可能說明 5?50s，不同的 PCR 儀可能有所區(qū)別。
每一個(gè)循環(huán) 92°C 50s , 63°C 10 min。按以下設(shè)置循環(huán)數(shù)。