對(duì)于一個(gè)新的靶分子建立實(shí)時(shí) PCR 定量分析的過程包括：①設(shè)計(jì)步驟一 PCR 引物和探針的選擇；②根據(jù)特定分析的要求，選擇實(shí)時(shí) PCR 的檢測方法。使用 SYBRGreen 的實(shí)時(shí) PCR 通常被用于優(yōu)化引物，且被主要用于在研究中檢測 PCR 產(chǎn)物 TaqMari 探針和分子信號(hào)提供了更好的特異性。本實(shí)驗(yàn)來源于 PCR 實(shí)驗(yàn)指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉試劑、試劑盒    MgCl2探針HotStmMix正向和反向擴(kuò)增引物模板 DNA
儀器、耗材    PCR 儀反應(yīng)管、毛細(xì)管或 96 孔的微量滴定板
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、材料

1. 緩沖液和溶液

MgCl2(25 mmol/L)

探針（例如分子信號(hào)）或 SYBRGreen(MolecularProbes)

2. 酶和酶緩沖液

HotStmMix，2X(含有 TaqDNA 聚合酶、PCR 緩沖液和 dNTP)

3. 核酸和寡核苷酸

正向和反向擴(kuò)增引物

模板 DNA

4. 設(shè)備

實(shí)時(shí) PCR 儀

合適的反應(yīng)管、毛細(xì)管或 96 孔的微量滴定板（按照不同的方法選用）

二、方法 A----ABI7700ORI-CYCLER

1.在 96 孔的微量滴定板上為每個(gè)反應(yīng)集中如下的 PCR 組分。混合 HotStart 混合物和引物及探針/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 種 10 倍稀釋的模板 DNA。

2XHotStartMix                                                    25ul
引物 A                                                               0.1~ 0.5umol/L
引物 B                                                               0.1~ 0.5umol/L
探針或 SYBRGreen                                          0.1~ 0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                             3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                                    10ul
水                                                                      補(bǔ)滿到 50ul

2.使用兩步（所有的 ABI7700TaqMan 定量分析）或三步 PCR。對(duì)于三步 PCR, 利用如下條件運(yùn)行 40~50 個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。

 

對(duì)于兩步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火溫度到 60°C。
*取決于 HotStart 程序。

3.繼續(xù)進(jìn)行下文步驟④的優(yōu)化方案。

三、方法 B—SMARTCYCLER

1.在適當(dāng)?shù)墓苤袨槊總€(gè)反應(yīng)集中如下的 PCR 組分?；旌?HotStart 混合物和引物及探針/SYBRGreen, 按要求的量加入模板。共有 5 種 10 倍稀釋的模板 DNA。

2XHotStartMix                                              2.5ul
引物 A                                                         0.3~0.8umol/L
引物 B                                                          0.3~0.8umol/L
探針或 SYBRGreen                                     0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                       3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                               5ul
水                                                                 補(bǔ)滿到 25ul

Smartcycler 要求使用的管子。

2.利用兩步或三步 PCR。對(duì)于三步 PCR，利用如下條件運(yùn)行 40 個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。

 

對(duì)于兩步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火溫度到 60°C。
*取決于 HotStart 程序。

3.繼續(xù)進(jìn)行下文步驟4的優(yōu)化方案。

四、方法 C-----LIGHTCYCLERPCR

1.在適當(dāng)?shù)墓苤袨槊總€(gè)反應(yīng)集中如下的 PCR 組分?；旌?HotStart 混合物和引物及探針/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 種 10 倍稀釋的模板 DNA。

2XFastStartMix                                              10ul
引物 A                                                            0.1~0.5umol/L
引物 B                                                            0.1~0.5umol/L
探針或 SYBRGreen*                                      0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                          3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                                 5ul
水                                                                   補(bǔ)滿到 20ul

*LightCycler 要求使用毛細(xì)管。

2.利用三步 PCR, 如下條件運(yùn)行 40(原文為 45—譯者改）個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。

 

3.繼續(xù)進(jìn)行下文步驟④的優(yōu)化方案。
優(yōu)化定置分析的實(shí)用方法（見 InnisandGelfand1990;HarrisandJones1997)

4.為了優(yōu)化擴(kuò)增子和引物，利用解鏈曲線功能分析實(shí)時(shí) PCR 產(chǎn)物，此功能在 ABI770上不能直接獲得。對(duì)單個(gè)產(chǎn)物而言，結(jié)果應(yīng)顯示其具有一個(gè)特異的解鏈峰，沒有表明形成引物二聚體的次級(jí)烽。當(dāng)解鏈曲線數(shù)據(jù)以一階導(dǎo)數(shù)表示時(shí)將會(huì)是一單峰。多個(gè)峰表明有其他的擴(kuò)增產(chǎn)物存在。如果檢測到多個(gè)峰，說明可能需要進(jìn)一步優(yōu)化鎂離子的濃度，但通常這表明需要重新設(shè)計(jì)引物。

5.為了優(yōu)化探針，可利用靶分子的 1 倍稀釋液，選擇任意單位作標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如假定DNA 的高濃度值是 107，由此它的 10 倍稀釋系列分別定為 107、106、105、104、103。鍵入這些數(shù)值作為起始量，在定量分析結(jié)束時(shí)用軟件作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用循環(huán)閾（Ct) 值和DNA 的起始濃度將可計(jì)算反應(yīng)效率。

6.與常規(guī) PCR 相似，需用一系列按 10 倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液做進(jìn)一步反應(yīng)，以優(yōu)化 MgCl2的濃度、引物濃度、探針濃度、退火溫度，以及調(diào)整 PCR 方案。

7.對(duì)于本身沒有快速循環(huán)操作方案的體系，可以嘗試進(jìn)行更短的循環(huán)方案，以減少定量分析的時(shí)間。