實(shí)驗(yàn)方法原理    
將小鼠的肝細(xì)胞從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。
實(shí)驗(yàn)材料    雄性 SD 大鼠
試劑、試劑盒 鈉小牛血清DMEM酶消化液I、ⅡNycodenzD-Hanks’液HBSS臺(tái)盼蘭
儀器、耗材    手術(shù)器械尼龍網(wǎng)相差顯微鏡熒光顯微鏡
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、實(shí)驗(yàn)步驟
 
1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺(tái)上剖腹，進(jìn)行門靜脈插管。
 
2. 以D-Hanks‘液灌注，同時(shí)剪開下腔靜脈，沖掉血液后，改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型膠原酶)。
 
3. 待肝臟變軟后，離體肝臟并剪碎，繼續(xù)以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型膠原酶)消化15 min，尼龍網(wǎng)過濾后以450 g 離心5 min(4℃，下同)。
 
4. 以HBSS 重懸沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz 液，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS，1450 g 離心16 min 后取界面細(xì)胞。
 
5. 以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞，以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并判斷存活率和產(chǎn)量，后按照常規(guī)方法接種(105 細(xì)胞/cm2 )，次日換液，以后每2-3 天換液一次。
 
6. 傳代方法：棄去培液后以D-Hanks’液洗兩次，加0.125%胰酶(原代加0.05% EDTA)消化，鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右)，以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA，可以不需離心)， 充分吹打后以 1:2-1:3 接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)(5% CO2，37℃)。

二、結(jié)果
接種次日，光鏡下可見細(xì)胞呈星芒狀，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴，熒光鏡下328  nm 處見自發(fā)熒光。附照片(圖 1)。
 

圖 1. 原代培養(yǎng)第 2 天的大鼠肝星狀細(xì)胞
收起 
注意事項(xiàng)    
1.  進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和α-SMA；后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。

2.  采用無須原位消化的方案，*可行，只不過消化時(shí)間更難控制！實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的或傳代后9代內(nèi)的細(xì)胞(5代以內(nèi))。
其他    
電鏡觀察：接種次日，光鏡下可見細(xì)胞呈星芒狀，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴，熒光鏡下328 nm處見自發(fā)熒光。

一、討論

進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化：Desmin  和α-SMA；后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。也采用過無須原位消化的方案，*可行，只不過消化時(shí)間更難控制！實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的或傳代后9代內(nèi)的細(xì)胞(

二、文獻(xiàn)

1. 袁桃霞，張錦生，張?jiān)露?，? 大鼠肝 Ito 細(xì)胞的體外培養(yǎng)及肝素對(duì)其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學(xué) 學(xué)報(bào),1996,23(2):90-93.

2. Huang GC, Zhang JS, Tang QQ. Involvement of C/EBP-α; gene in in vitro activation of rat hepatic stellate cells. Biochem Biophys Res Commun,2004,324(4):1309-1318.