實驗方法原理    
腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，是比較容易培養(yǎng)的細胞。癌細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞界限清晰，對營養(yǎng)要求不高，在體外培養(yǎng)可無限制傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)的細胞一旦建立細胞系就需要進行一系列細胞生物學特性鑒定。

腫瘤細胞可置于低溫下保存。-80℃下可保存細胞半年至一年, 液氮可保存細胞5—10 年, 甚至更長的時間。
實驗材料    腫瘤細胞
試劑、試劑盒    液氮EDTA保種液
儀器、耗材    恒溫水浴鍋低溫離心機方瓶CO2培養(yǎng)箱-70度冰箱彎管顯微鏡離心管濾膜
實驗步驟    
一、細胞復蘇與培養(yǎng)
 
將液氮或-80℃保存的腫瘤細胞于37℃ 水浴, 快速溶化, 用8.0ml 培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細胞懸液, 于1500 轉/分, 離心3 分鐘。棄上清, 再吸取8.0ml 培養(yǎng)基質混勻細胞沉淀, 再1500 轉/分, 離心3 分鐘, 棄上清, 細胞沉淀用1.0ml 培養(yǎng)基混勻, 備用。另取一個75cm2 方瓶, 加入14.0ml 培養(yǎng)基質, 將上述制備的含腫瘤細胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37℃，5%CO2 孵育箱中培養(yǎng)。若此腫瘤細胞懸浮生長, 大約3－4 天細胞基質會變黃, 5.0ml 細胞懸液可傳代一個方瓶培養(yǎng), 可用3－4 個方瓶培養(yǎng), 一個方瓶中呈對數生長的腫瘤細胞可達1-1.5x107 個, 根據試驗所需, 可決定傳代的次數。若此腫瘤細胞呈貼壁生長, 經過3-4 天, 腫瘤細胞生長至80%-95% 單層時, 棄上清, 用0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細胞用0.25%胰酶1.0ml), 處理腫瘤細胞大約3-5 分鐘, 用倒置顯微鏡觀察，當90% 的腫瘤細胞變圓時, 即可用彎管吹打并將消化的細胞轉移到15ml 離心管中, 于1500 轉/分下，離心3 分鐘, 棄上清, 加少許培養(yǎng)基混勻, 可傳代3 個 75cm2方瓶擴大培養(yǎng)。
 
二、細胞凍存
 
將對數生長的腫瘤細胞用1 個75cm2方瓶按上述方法收集, 于1500 轉/分離心3 分鐘,棄上清, 用保種液(含10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻, 分別加入到2-3 只保種管中, 寫上腫瘤細胞名稱, 時間, 保種者姓名, 放-80℃保存, 次日將它們轉移到液氮中保存(注: -80℃下可保存細胞半年至一年, 液氮可保存細胞5-10 年, 甚至更長的時間)。以上所有物品均需經過高溫滅菌( 121℃, 30 分鐘)，培養(yǎng)基質則經過過濾(0.22uM)除菌, 所有操作均必須遵守無菌操作技術, 避免細菌、真菌、病原體、衣原體等污染。
收起 
注意事項    
所有操作均必須遵守無菌操作技術, 避免細菌、真菌、病原體、衣原體等污染。
其他    
1.癌細胞經常重疊生長，如果混有成纖維細胞，應當在傳代時采用消化消除法及反復貼壁法加以清除。

2.在早期傳代時要適當提高接種濃度。

3.對于增殖能力極低的細胞，應放入飼養(yǎng)層培養(yǎng)，并加入一些促生長物質，如胰島素，雌激素，EGF，氫化考的松，軟鐵蛋白等因子。