實(shí)驗(yàn)方法原理    
本實(shí)驗(yàn)首先是制備植物新鮮組織勻漿、過濾,分離出完整的葉綠體,然后通過蔗糖密度梯度離心,把葉綠體與其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離開來。完整葉綠體經(jīng)蛋白酶K酶解后,再通過酚-抽提獲得高純度的葉綠體DNA。
實(shí)驗(yàn)材料    植物新鮮幼嫩葉片
試劑、試劑盒    緩沖液A(提取緩沖液)緩沖液B(裂解緩沖液)TE緩沖液蔗糖溶液乙酸鈉乙醇
儀器、耗材    攪拌器冷凍離心機(jī)(Sorvall、Beckman等)筆刷(藝術(shù)筆刷)甩平式轉(zhuǎn)頭的超速離心機(jī)和合適的離心管恒溫水浴鍋用于酚抽提的50ml離心管30ml的離心管1.5ml的微量離心管微型離心機(jī)(1.5ml管)-20℃冰箱真空干燥儀
實(shí)驗(yàn)步驟    
以下所有操作除特別指明外均在4℃進(jìn)行。將攪拌器和離心管預(yù)冷,使用冷藏的緩沖液并在冰筒中操作。

1.準(zhǔn)備750ml緩沖液A,使用前往500ml緩沖液中加入BSA。

2.收集25～30g健康的嫩葉,在提取之前可將植株置于黑暗中培養(yǎng)24～28h以降低淀粉含量。如果植物材料已被感染或弄臟了,可先用次氯酸鈉(5%)處理5min,然后用自來水漂洗2～3次。

3.除去葉片中間的葉脈,稱重。此法適用于約20g的植物材料。將葉片切成1cm2大小的碎片,將10g碎片置于含有BSA的約200～250ml的緩沖液A中(只有在勻漿時(shí)使用的緩沖液A中加入BSA),在攪拌器中高速勻漿,每次約10s,重復(fù)2～3次。

4.用50μm的尼龍篩過濾提取物。在含BSA的200～250ml緩沖液A中對所剩的碎片再次勻漿和過濾。不能通過50μm尼龍篩的勻漿物可集中起來再勻漿,每次10s,重復(fù)兩次,再過濾。

5.用20μm的尼龍篩對提取物進(jìn)行第二次過濾。

6.提取液3000r/min離心10min。

7.用軟筆刷輕輕將沉淀重懸于30ml不含BSA的緩沖液A中,再離心。綠色沉淀的底部可見白點(diǎn),那是淀粉,應(yīng)盡量避免重懸起淀粉。根據(jù)淀粉的含量,可以重復(fù)這一沖洗步驟4～6次。

8.在沖洗的同時(shí),可以制備蔗糖梯度液。分級梯度液底層為3.5ml60%的蔗糖溶液,中間為3.5ml40%的蔗糖溶液,頂層為3.0ml20%的蔗糖溶液,不同梯度層要輕輕混勻,得到擴(kuò)散中間相?？梢杂靡粋€(gè)長的巴氏吸管小心地在層間上下攪動幾次(巴氏吸管的末端開口應(yīng)封上)。

9.小心將沉淀物重懸于總體積2～6ml的緩沖液A中,將懸液分別加入有分級梯度液的2～6個(gè)小管中。梯度平衡后置于水平轉(zhuǎn)頭上26000r/min4℃離心1h。

10.將位于45%～20%蔗糖溶液中間層的葉綠體帶用寬口移液管轉(zhuǎn)至50ml的離心管中。

11.緩慢加入3倍體積的緩沖液A(防止葉綠體破裂)。開始時(shí)逐滴加入并輕輕攪勻(全部加完約要10～15min)。5000r/min離心5min,收集葉綠體。

12.小心將沉淀重懸于3ml緩沖液A中,加入1/5體積的緩沖液B(用前加入蛋白酶K),并于50℃保溫15min,使葉綠體裂解。

13.在室溫下抽提葉綠體DNA2次。加入1倍體積的酚(以TE飽和),顛倒小管數(shù)次混勻。室溫下5000r/min離心10min,使兩相分離。收集上層溶液,再用1倍體積的酚-(1∶1,V/V)抽提一次。

14.將DNA溶液(水相)轉(zhuǎn)至一個(gè)30ml的離心管中,加入1/10體積3mol/L乙酸鈉和2.5倍體積的99%乙醇,-20℃沉淀DNA過夜。

15.在4℃下,10000r/min離心15min,收集DNA。

16.棄上清液,真空抽干沉淀(不要過度抽干沉淀)。

17.將DNA溶于400μlTE緩沖液,這可能需要幾個(gè)小時(shí),將小管放于冰上操作。

18.把DNA轉(zhuǎn)至一Eppendorf管中,加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和2體積的99%乙醇,-20沉淀DNA過夜。

19.在微型離心機(jī)上,4℃,13000r/min離心15min,收集DNA。

20.棄上清液,用20%乙醇清洗沉淀,再離心,重復(fù)清洗步驟。離心,真空抽干沉淀。

21.將沉淀溶于50～150μlTE緩沖液中,在-20℃或4℃保存。DNA產(chǎn)量一般可達(dá)10～100μg。
收起 
注意事項(xiàng)    
1.加入每管蔗糖梯度液的葉綠體量會影響DNA的純度,一般來說,25ml蔗糖梯度液中加入10～20g新鮮葉片中所得到的葉綠體。本實(shí)驗(yàn)中所用的梯度液為10ml,為避免使本程序中使用的量小一些的梯度液過載,可以將葉綠體分裝在2～6個(gè)管中,梯度液的總體積應(yīng)根據(jù)不同植物材料摸索而定。

2.人們通常用CsCl梯度溶液進(jìn)一步純化葉綠體DNA,而且CsCl純化的葉綠體DNA可以用于克隆,但CsCl梯度離心耗時(shí)更多。本實(shí)驗(yàn)程序也得到高純度的葉綠體DNA,可以檢驗(yàn)其純度能否用于克隆
其他    
具體試劑描述：

1.緩沖液A(提取緩沖液):0.3mol/L山梨醇 ,50mmol/L Tris-HCl,20mmol/L EDTA,0.1% BSA(用前加)。

2.緩沖液B(裂解緩沖液):0.5%SDS,50mmol/L Tris-HCl,0.4mmol/L EDTA,0.1%蛋白酶K(W/V),pH8.0。蛋白酶K用前加,由于緩沖液B在室溫下會出現(xiàn)沉淀,因此,使用前可先將緩沖液加熱。

3.TE緩沖液:10mmol/L Tris,5mmol/L Na2EDTA,pH7.5。

4.蔗糖梯度:60%、45%和30%的蔗糖,溶于緩沖液A。

5.尼龍篩(50μm和20μm),酚(TE緩沖液飽和,pH8.0),99%和70%的乙醇,3mol/L乙酸鈉。