細(xì)胞培養(yǎng)是每個(gè)實(shí)驗(yàn)人員的*技能，俗話說：細(xì)胞養(yǎng)得好，實(shí)驗(yàn)沒煩惱，然而事實(shí)卻是，實(shí)驗(yàn)室的小細(xì)胞們經(jīng)常容易“生病”，別人的培養(yǎng)基粉紅透亮，細(xì)胞長勢喜人，而自己在細(xì)胞培養(yǎng)中卻經(jīng)常出現(xiàn)各種不明原因的渾濁和沉淀，這是什么情況呢?

　　細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)沉淀主要有2大原因：

　　一，細(xì)胞本身被污染;

　　二，培養(yǎng)基中有金屬、蛋白和其他培養(yǎng)基組分的沉淀;

　　首先，我們先來看看細(xì)胞污染。

　　1，細(xì)菌/真菌/酵母污染

　　細(xì)菌、真菌和酵母污染相對(duì)來說“道行尚淺”，是因?yàn)樗鼈內(nèi)菀妆蝗庋酆惋@微鏡識(shí)別，如下圖：

　　在這三種污染重，細(xì)菌污染是三者之中個(gè)性較強(qiáng)的一位，有一定的辨別難度，常見的細(xì)菌有：桿狀菌、球狀菌和螺旋狀菌。

　　2，支原體污染

　　支原體可是細(xì)胞的天敵，這是因?yàn)橹гw的平均直徑只有 0.1~0.3 µm ，這在顯微鏡下都無法識(shí)別。

　　并且，由于支原體污染初期生長緩慢，更是沒有肉眼可以觀察到的現(xiàn)象。

　　檢測：常用的檢查方法為培養(yǎng)檢測法，即取1mL細(xì)胞培養(yǎng)液加入支原體液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5天后，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。如果變黃則懷疑該細(xì)胞受到支原體污染。如果不變色，則盲傳一代。

　　若顏色變黃，可接支原體固體培養(yǎng)基，于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天，觀察有無“煎蛋”狀支原體菌落。一旦發(fā)生污染即淘汰該細(xì)胞和培養(yǎng)液。

　　圖：支原體污染 (左側(cè)：電鏡照片(×30k); 右側(cè)：電鏡照片(×12k))

　　此外，支原體污染還可用熒光染色法和相差顯微鏡觀察法等檢測方法,或者直接購買支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

　　處理措施：

　　●定期用支原體試劑盒檢測;

　　●換液可以減緩污染情況，但無法*;

　　●支原體清除試劑盒可以達(dá)到較好效果;

　　●小鼠腹腔巨噬細(xì)胞清除法。

　　推薦——支原體清除培養(yǎng)基（貨號(hào)：

　　支原體清除培養(yǎng)基是含有清除“支原體”的特殊成分(一種混合制劑，可通過抑制DNA和支原體生長所必須的相關(guān)蛋白合成來取得良好的支原體清除效果，上挽救珍貴的細(xì)胞，減少因支原體污染帶來的損失)。

　　本產(chǎn)品經(jīng)過了數(shù)十種細(xì)胞的測試和長期的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)細(xì)胞無害，對(duì)清除支原體污染*，能夠很好的抑制和殺滅支原體。如圖：

　　圖：使用支原體清除培養(yǎng)基處理之后的細(xì)胞

　　3，真核細(xì)胞污染

　　真核細(xì)胞污染是指一個(gè)細(xì)胞系中混入了其它細(xì)胞。由于各種細(xì)胞的外形大小差異甚微，這種污染同樣很難被識(shí)別。

　　一般碰到這種情況，只能是將細(xì)胞丟棄了，因?yàn)檫@將對(duì)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性產(chǎn)生重大的影響。

　　接下來，我們來看看培養(yǎng)基的問題。

　　如果排除了污染，細(xì)胞培養(yǎng)基中的渾濁通常被解釋為金屬、蛋白和其他培養(yǎng)基組分的沉淀，沉淀物可能損害細(xì)胞健康，因?yàn)樗麄兺ㄟ^螯合可移除養(yǎng)分和其他需要的組分，從而改變培養(yǎng)基的組成。

　　產(chǎn)生沉淀的可能原因及解決方案：

　　1，溫度變化

　　在細(xì)胞培養(yǎng)中，溫度是引起沉淀的主要因素之一。當(dāng)遭遇溫度的變化時(shí)，高分子量血漿蛋白會(huì)從溶液中析出;

　　解決方案：

　　大家在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)一定要注意按照說沒事要求選擇的培養(yǎng)基儲(chǔ)存和操作方法，并且要避免反復(fù)凍融。

　　2，失水誘導(dǎo)的濃度改變

　　如果培養(yǎng)基可能蒸發(fā)，培養(yǎng)基組分(包括鹽) 的濃度將會(huì)增加，特別是培養(yǎng)基表面可能容易形成

　　晶體沉淀。

　　解決方案：

　　●確保培養(yǎng)瓶/板不經(jīng)歷蒸發(fā)，監(jiān)測孵育箱加濕效果;

　　●密封培養(yǎng)器皿避免脫水。

　　3，鈣鹽

　　制備無血清培養(yǎng)基時(shí)，組分添加的順序可能導(dǎo)致不可溶分子的形成。鈣鹽尤其容易沉淀，比如CaCl2和MgSO4在溶液中反應(yīng)產(chǎn)生CaSO4晶體。高壓滅菌和pH值不穩(wěn)定會(huì)加劇這一問題。

　　解決方案：

　　●逐個(gè)添加其它培養(yǎng)基組分之前，用去水離子水單獨(dú)溶解CaCl2

　　●可添加緩沖液避免滲透壓的變化。

　　4，金屬補(bǔ)充物

　　銅、鐵和鋅等金屬離子是細(xì)胞生長所必需的，是無血清培養(yǎng)基的重要補(bǔ)充物。

　　培養(yǎng)系統(tǒng)中其他血清組分的缺失可能導(dǎo)致這些金屬沉淀，為細(xì)胞形成有毒的環(huán)境。

　　在較高pH環(huán)境下(一般>8時(shí))，碳酸鹽和氫氧根離子與銅離子、磷酸鹽和氫氧根離子與鐵離子、碳酸鹽、磷酸鹽和氫氧根離子與鋅離子、氫氧根離子與鎂離子易形成不溶性沉淀物;

　　在氧化條件下，銅和鋅更易于沉淀。

　　金屬沉淀物對(duì)照顏色表

　　解決方案：

　　●鐵結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白的加入可防止鐵在培養(yǎng)中沉淀;

　　●可添加緩沖液避免滲透壓的變化。

　　●向培養(yǎng)基中補(bǔ)充甘露醇或丙酮酸以結(jié)合過氧化氫，盡可能降低氧化應(yīng)激。

　　學(xué)會(huì)對(duì)各種污染情況的辨別和處理是一項(xiàng)*的實(shí)驗(yàn)技能，希望大家在看完我們的文章后結(jié)合你的實(shí)驗(yàn)操作，學(xué)會(huì)如何應(yīng)對(duì)細(xì)胞污染。