【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬細(xì)小病毒PCR檢測試劑盒

英文名稱：Porcine pamovirus PCR Detection Kit

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于豬細(xì)小病毒檢測，不進(jìn)行病毒分型，對豬細(xì)小病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

利用試劑盒提取DNA，在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35次循環(huán)，終使擴(kuò)增DNA段放大了數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增DNA段進(jìn)行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到DNA片段的擴(kuò)增帶。

【主要組成成份】

組成	25T/盒	50T/盒
PPV  PCR反應(yīng)液	375 μL×1管	750 μL×1管
PPV 混合酶液	75 μL×1管	150 μL×1管
PPV 陽性對照	40 μL×1管	40 μL×1管
PPV 陰性對照	40 μL×1管	40 μL×1管
說明書	1份	1份

注：陰性對照為豬基因組DNA，陽性對照為PPV經(jīng)滅活處理的核酸提取物。

【儲存條件及有效期】-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。

【需自備的物品】

PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、可調(diào)移液器、瓊脂糖等相關(guān)試劑及設(shè)備。

【注意事項(xiàng)】

1.病毒具有很強(qiáng)的感染能力，操作前必須準(zhǔn)備好各種防御措施。

2.操作時(shí)須嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行，廢物必須放入含消毒液的廢物缸，以免污染實(shí)驗(yàn)室和工作人員。

3.為避免其他核酸的污染而出現(xiàn)假陽性，必須使用不含DNA和RNA的離心管、吸管、槍頭、試劑和手套，操作人員須戴口罩。

【實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備】

如果是提取病毒RNA，請選用RNase free Tip槍頭和1.5 ml離心管或?qū)岊^和離心管用0.1% DEPC水處理后再使用。

【操作步驟】

1.樣品處理：每份樣品分別處理。

（1）新鮮采集的咽拭子、鼻拭子和糞便標(biāo)本，并使用滅菌生理鹽水懸浮。

（2）標(biāo)本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃。

（3）標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 提取過程：

用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3. PCR擴(kuò)增

（1）每份總體積20 µL，含15 µL PCR反應(yīng)液（用前混勻），3µL 混合酶液，2 µL模板DNA。

例如：n份樣品，配制n+1份，15×（n+1）PCR反應(yīng)液， 3×（n+1）混合酶液勻后取18 µL分裝成n份，分別加入2 µL模板DNA，作好標(biāo)記。

（2）在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序： 94 ℃ 3 min；循環(huán)94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。

4. 電泳

稱1.5 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中，加入1倍TAE電泳緩沖液100 mL（取2 mL 50倍TAE電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至100 mL），于微波爐中熔解，待冷卻至50℃左右再加入50 µL染色液（自備）混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4µL上樣緩沖液（自備）混勻后取10 µL點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120V電壓于1倍TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。（注：染色液是2000×，上樣緩沖液是6×）

【結(jié)果判定】

陽性對照出現(xiàn)177 bp擴(kuò)增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)177 bp擴(kuò)增帶為豬細(xì)小病毒陽性，否則為陰性。