產(chǎn)品及特點(diǎn)

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌(ESBL-Escherichia coli)是一種在醫(yī)院內(nèi)感染的常見機(jī)會(huì)致病菌，各臨床科室以及標(biāo)本類型中均有檢出，科室分布以普外科為主，標(biāo)本類型以傷口分泌物標(biāo)本為主，常引起外殼感染性疾病，該細(xì)菌對(duì)多種抗生素有較強(qiáng)的耐藥性，所以醫(yī)院要加強(qiáng)對(duì)該細(xì)菌的耐藥性的檢測(cè)與監(jiān)控，積極做好細(xì)菌的培養(yǎng)和藥物敏感性試驗(yàn)，規(guī)范合理使用抗生素，以控制耐藥菌的出現(xiàn)和流行，因此快速檢測(cè)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌具有重要意義。熒光定量PCR是檢測(cè)傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

• 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
• 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
• 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
• 特異性高，引物是根據(jù)人超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌高度保守的VP1區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
• 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
• 本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。

自備試劑

樣品DNA。

使用方法

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對(duì)照。

• 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
• 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
• 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
• 換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
• 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
• 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

• 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL陽性對(duì)照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
• 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)細(xì)菌DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的細(xì)菌DNAout或柱式細(xì)菌DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送50次免DNA提取的天凈沙DNA釋放劑，本產(chǎn)品的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟。

三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

• 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
• 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

• 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

五、數(shù)據(jù)處理

• 以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

六、電泳檢測(cè)

• 如果有必要電泳確認(rèn)，可取10-20μL PCR產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物的大小為400 bp。但電泳非常容易污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境，建議不輕易采納。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒