實(shí)驗(yàn)材料 孕鼠新生小鼠

試劑、試劑盒 RPMI1640培養(yǎng)基牛血清胰蛋白酶Hanks液酒精青霉素鏈霉素

儀器、耗材 培養(yǎng)瓶青霉素瓶廢液缸血球計(jì)數(shù)板蠟盤手術(shù)器械大頭針離心管小玻璃漏斗三角燒瓶平皿吸管試管移液管無(wú)菌紗布無(wú)菌眼科剪

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_(tái)內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。

 

二、用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。

 

三、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1 mm2），再用Hank's液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。

 

四、將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。

 

五、翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。

 

六、于37℃靜置3-5小時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

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注意事項(xiàng)

1.  嚴(yán)格進(jìn)行動(dòng)物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動(dòng)物皮膚先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。

 

2.  嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作，防止細(xì)菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。

 

3.  吸取液體前，瓶口和吸管進(jìn)行火焰消毒；吸取液體時(shí)，避免瓶口和吸管碰撞。

 

4.  離心管入臺(tái)前，管口、管壁應(yīng)消毒。

 

5.  實(shí)驗(yàn)者離開(kāi)超凈臺(tái)時(shí)，要隨時(shí)用肘部關(guān)閉工作窗。

 

6.  使用過(guò)的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個(gè)器皿中繼續(xù)消毒，在浸泡器械時(shí)剪刀口要叉開(kāi)放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。

 

7.  器材使用時(shí)既要注意用火焰消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。經(jīng)火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷卻。

 

8.  超凈臺(tái)內(nèi)溫度、濕度較大，在夏天工作時(shí)臺(tái)內(nèi)散熱更慢，因此進(jìn)行細(xì)胞懸液混勻、接種時(shí)，離火焰要稍微遠(yuǎn)些。

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其他

一、操作要領(lǐng)

 

1.  混勻操作要領(lǐng)

 

（1）火焰消毒吸管，用Hank's液冷卻和濕潤(rùn)管內(nèi)壁（這是因?yàn)閯偡蛛x的組織細(xì)胞易粘在管壁上）。

 

（2）吸管頭插入管底。

 

（3）用吸管反復(fù)輕輕吹打組織塊。

 

2.  器械的使用

 

（1）用工作臺(tái)消毒鑷子取浸泡在酒精中消毒的器械。

 

（2）器械置無(wú)菌干紗布內(nèi)嚓一下。迅速通過(guò)火焰，冷卻后使用。

 

（3）用過(guò)的器械置另一加蓋的器皿中再消毒。

 

（4）器械按浸泡消毒的順序使用。

 

（5）各套再消毒器械不可混用。

 

3.  除去組織塊多余水分

 

用吸管將組織塊推向青霉素瓶一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向?qū)?cè)的多余水分。

注意：多余水分若不除去，會(huì)使組織塊剪切不細(xì)，消化后的細(xì)胞懸液清亮（細(xì)胞數(shù)少），并可見(jiàn)消化液中有線狀或絮狀物漂浮。

 

4.  細(xì)胞計(jì)數(shù)

（1）用吸管混勻待計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液。

 

（2）將一小滴細(xì)胞懸液從蓋玻片與載玻片交界部位滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)池中。

 

（3）沉降1分鐘，低倍鏡下計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板四大中格的結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞，小細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)為1。

 

（4）計(jì)數(shù)時(shí)，如果細(xì)胞壓在格上，則數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。然后按下式計(jì)算出每毫升懸液中的細(xì)胞數(shù)。

（四大中格細(xì)胞數(shù)/4）*10 000=細(xì)胞數(shù)/毫升