實驗方法原理 細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。

 

Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結合蛋白，初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于結合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。

 

PS轉移到細胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用Annexin V結合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。

實驗材料 細胞

試劑、試劑盒 HEPES緩沖液NaClCaCl2PIANNEXIN V-FITC試劑盒

儀器、耗材 流式細胞儀

實驗步驟

一、試劑與儀器

 

1.  孵育緩沖液：10 mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2。

 

2.  標記液：將FITC- Annexin V（寶靈曼公司產品）和PI加入到孵育緩沖液中，終濃度均為1 ug/ml。

 

3.  流式細胞儀。

 

二、實驗步驟

 

1.  細胞收集：懸浮細胞直接收集到10 ml的離心管中，每樣本細胞數(shù)為（1~5）×106/mL 500~1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。

 

2.  用孵育緩沖液洗滌1次，500~1 000 r/min離心5 min。

 

3.  用100 ul的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10~15 min。

 

4.  500~1 000 r/min離心5 min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。

 

5.  加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不時振動。

 

6.  流式細胞儀分析：流式細胞儀激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。

 

7.  結果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴毎c此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。