實(shí)驗(yàn)方法原理 細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，目前早期識(shí)別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。

 

Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。

 

PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性的檢測(cè)方法。

實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞

試劑、試劑盒 HEPES緩沖液NaClCaCl2PIANNEXIN V-FITC試劑盒

儀器、耗材 流式細(xì)胞儀

實(shí)驗(yàn)步驟

一、試劑與儀器

 

1.  孵育緩沖液：10 mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2。

 

2.  標(biāo)記液：將FITC- Annexin V（寶靈曼公司產(chǎn)品）和PI加入到孵育緩沖液中，終濃度均為1 ug/ml。

 

3.  流式細(xì)胞儀。

 

二、實(shí)驗(yàn)步驟

 

1.  細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接收集到10 ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為（1~5）×106/mL 500~1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。

 

2.  用孵育緩沖液洗滌1次，500~1 000 r/min離心5 min。

 

3.  用100 ul的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10~15 min。

 

4.  500~1 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。

 

5.  加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)。

 

6.  流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488 nm，用一波長(zhǎng)為515 nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)大于560 nm的濾器檢測(cè)PI。

 

7.  結(jié)果判斷：凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會(huì)著染而沒(méi)有紅色熒光信號(hào)。正?；罴?xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。