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細(xì)胞凋亡之形態(tài)學(xué)檢測法
閱讀：317 發(fā)布時(shí)間：2019-9-11| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，使用合適的顯微鏡檢測凋亡細(xì)胞形態(tài)變化。 |
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| 實(shí)驗(yàn)材料 | Hela細(xì)胞Jurkat細(xì)胞 |
| 試劑、試劑盒 | DAPIHoechst蒸餾水PBS |
| 儀器、耗材 | 光學(xué)顯微鏡倒置顯微鏡透射電子顯微鏡熒光顯微鏡共聚焦激光掃描顯微鏡 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
1. 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
2. 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
二、 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258)，DAPI。三種種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。
Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1 mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋，終濃度為10 ug/ml。
DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1 mg/ml的濃度，使用終濃度一般為10 ug/ml。
結(jié)果評判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。
三、 透射電子顯微鏡觀察
結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
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