實(shí)驗(yàn)方法原理 根據(jù)聚合酶技術(shù)把辣根過氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子結(jié)合在多聚酶上形成多聚物分子,其與待檢的抗原特異性的結(jié)合后，加入底物顯色。

實(shí)驗(yàn)材料 石蠟切

試劑、試劑盒 PBS檸檬酸鹽緩沖液蒸餾水增強(qiáng)劑酶標(biāo)抗鼠 兔聚合物蘇木素酒精二甲苯樹膠鹽酸二氨基聯(lián)苯胺

儀器、耗材 烘箱微波盒塑料切片架顯微鏡膠頭滴管

實(shí)驗(yàn)步驟

1.  石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時(shí)，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。

 

2.  取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’。（注：不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的，視具體情況而定）

 

3.  每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。

 

4.  除去PBS液，每張切片加1滴相應(yīng)的抗體（相應(yīng)稀釋倍數(shù)），室溫下孵育2小時(shí)。

 

5.  PBS沖洗3×5’。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。

 

6.  除去PBS液，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’。

 

7.  除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液（二氨基聯(lián)苯胺），顯微鏡下觀察5分鐘。

 

8.  蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。

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注意事項(xiàng)

1.  在切片加上一抗后，第二抗體標(biāo)記多聚螯合物酶（HRP）的復(fù)合物與一抗結(jié)合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信號(hào)有顯著的放大，其敏感性較SABC、SP法高。

2.  由于多聚物在體內(nèi)不存在，又不使用生物素，從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。

3.  辣根過氧化物酶與二抗結(jié)合在多聚物上，替代傳統(tǒng)方法的 二抗、三抗，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，且試劑孵育時(shí)間短，只需15分鐘，使得免疫組化方法更簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間比SABC、SP法大為縮短。

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其他

一、特點(diǎn)

 

1.  在切片加上一抗后，第二抗體標(biāo)記多聚螯合物酶（HRP）的復(fù)合物與一抗結(jié)合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信號(hào)有顯著的放大，其敏感性較SABC、SP法高。

2.  由于多聚物在體內(nèi)不存在，又不使用生物素，從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。

3.  辣根過氧化物酶與二抗結(jié)合在多聚物上，替代傳統(tǒng)方法的 二抗、三抗，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，且試劑孵育時(shí)間短，只需15分鐘，使得免疫組化方法更簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間比SABC、SP法大為縮短。