一、選擇熒光標(biāo)記要匹配

熒光直標(biāo)抗體的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)在于它為多重檢測(cè)提供了機(jī)會(huì)，比如現(xiàn)在一些先進(jìn)的流式細(xì)胞儀能檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞中 20 多個(gè)離散參數(shù)。在設(shè)計(jì)多重實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮每種熒光基團(tuán)的*性質(zhì)，如大吸收波長和大發(fā)射波長，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素。

對(duì)于免疫熒光分析方法，人們要同時(shí)檢測(cè)組織或細(xì)胞樣本中的多個(gè)抗原，常常會(huì)利用直標(biāo)一抗進(jìn)行免疫熒光共染色，這時(shí)一般盡量選擇光譜重疊比較少的熒光基團(tuán)進(jìn)行組合。比如，我們會(huì)選擇一個(gè) AF488 標(biāo)記的抗體和另一個(gè) AF647 標(biāo)記的抗體進(jìn)行兩個(gè)不同蛋白的共染色。

對(duì)于流式細(xì)胞分析方法，我們對(duì)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)抗原所需的熒光抗體的選擇相對(duì)容易一些。由于在流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中，熒光抗體對(duì)單細(xì)胞懸液的標(biāo)記效果直接影響實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)質(zhì)量。因此，需要考慮各種影響流式抗體品質(zhì)及檢測(cè)效果的因素，例如抗體特異性、熒光素信號(hào)強(qiáng)弱、熒光素標(biāo)記方式、同型對(duì)照等。首先，選擇流式熒光抗體一定要滿足基本的條件：抗體有較好的目標(biāo)蛋白特異性及適用的反應(yīng)種屬。

其次，要根據(jù)目標(biāo)蛋白的豐度，選擇匹配的熒光素，來保證合適的熒光強(qiáng)度。如不同熒光標(biāo)記在不同的儀器上強(qiáng)度不同，以 FACS Calibur 儀器為例：PE>APC>PE-Cy5>PerCP>FITC>PerCP-Cy5.5。通常來說，PE ，適用于弱表達(dá)抗原。FITC 強(qiáng)度較弱，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原，使用范圍比較廣。用戶需根據(jù)檢測(cè)的目標(biāo)蛋白進(jìn)行具體選擇。如果同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)：確認(rèn)流式細(xì)胞儀能檢測(cè)多少個(gè)通道：流式抗體每個(gè)通道只能選擇 1 種熒光素。各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。如：實(shí)驗(yàn)者同時(shí)檢測(cè)三個(gè)指標(biāo)，可以在下圖中綠色、黃色和紅色三個(gè)通道中各選一個(gè)適當(dāng)?shù)臒晒馑貥?biāo)記，F(xiàn)ITC、PE 和 PE-cy5。切忌所有指標(biāo)選擇同一個(gè)通道的熒光標(biāo)記，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響后結(jié)果。

因此，流式細(xì)胞儀的通道越多，同一份樣本能同時(shí)做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多。常用熒光標(biāo)記包括 FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC 等。

二、熒光試劑保存要妥當(dāng)

盡管許多熒光基團(tuán)具有相對(duì)的光穩(wěn)定性，但在保存和染色過程中若未能避光, 則可能導(dǎo)致熒光基團(tuán)-抗體結(jié)合物降解，引起假陰性結(jié)果。熒光物質(zhì)必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護(hù)其光譜完整性。另外，串聯(lián)的熒光基團(tuán)（如 PE-Cy5）對(duì)頻繁操作引起的不穩(wěn)定性特別敏感，大家要注意。

三、操作方案要優(yōu)化

1. 免疫熒光操作方案的優(yōu)化

對(duì)于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞樣品處理、固定、通透、封閉、抗體孵育到后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量，才能終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹悠分苽洌ㄍㄋ椎恼f法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的，其質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，這一步關(guān)鍵的是玻片的處理以及細(xì)胞的活力。固定和通透步驟重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。封閉用與指標(biāo)一抗相同來源種屬的正常血清來進(jìn)行封閉。對(duì)于直標(biāo)一抗的免疫熒光染色，我們需要考慮抗體的建議稀釋度，以實(shí)現(xiàn)高的信噪比。若抗體濃度過低，則熒光信號(hào)較弱，可能難以與背景區(qū)分開，但抗體濃度過高，則會(huì)導(dǎo)致較高的背景染色。

另外，要注意各步驟之間的*洗滌的重要性，利用生理溶液來洗滌，可去除未結(jié)合的熒光試劑，或那些只是粘在目標(biāo)上而非特異性結(jié)合的熒光試劑，從而提高信噪比。后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在 4℃ 或- 20℃ 避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。盡管免疫熒光技術(shù)提供了準(zhǔn)確的結(jié)果，但也存在一些缺點(diǎn)，包括自發(fā)熒光、熒光信號(hào)的淬滅。因此，可以針對(duì)上述問題，利用一些免疫熒光細(xì)胞處理試劑去進(jìn)行預(yù)處理，以減少自發(fā)熒光或熒光信號(hào)的淬滅。

2. 流式細(xì)胞術(shù)操作方案的優(yōu)化

流式細(xì)胞術(shù)操作方案的優(yōu)化，主要包括以下幾個(gè)方面：

選擇固定劑

（1）變性試劑：通過將蛋白變性再固定在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的有機(jī)溶劑，如 90% 甲醇、70% 乙醇等，變性試劑一般與細(xì)胞膜磷脂雙分子層有相互作用，因此同時(shí)具有破膜作用。如果采用變性試劑固定細(xì)胞，而抗體用來標(biāo)記胞內(nèi)蛋白，則不需要另外破膜。

（2）交聯(lián)試劑：通過自由氨基基團(tuán)使蛋白分子交聯(lián)起來固定蛋白，如 4% 多聚甲醛、10% 福爾馬林溶液等，如果采用交聯(lián)試劑固定細(xì)胞，而抗體用來標(biāo)記胞內(nèi)蛋白，則需要另外破膜。

優(yōu)化抗體使用濃度

抗體滴定方法：用同種細(xì)胞，相同細(xì)胞數(shù)量與反應(yīng)體積，加入不同量的抗體計(jì)算陽性峰熒光強(qiáng)度及信噪比（S/N>3）。

（1）滴定的濃度范圍盡量大，至少 5 個(gè)左右。

（2）滴定實(shí)驗(yàn)條件要和實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件一致，如反應(yīng)溫度、pH 等。

（3）弱表達(dá)或不分群的抗原不適合做滴定。

封閉 Fc 受體

Fc 受體是指細(xì)胞表面能夠與免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM、IgE 和 IgD）結(jié)合的分子，存在于 NK 細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的表面。FcR 能夠與抗體的 Fc 段結(jié)合，在檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生假陽性。

（1）商品化的 Fc Block 試劑：重組人 IgG，小鼠 CD16 /CD32 抗體。

（2）人血清或相應(yīng)物種的血清

排除死細(xì)胞

死細(xì)胞的自發(fā)熒光水平很高，且容易攝取抗體導(dǎo)致非特異性結(jié)合，終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 還可能會(huì)釋放 DNA，DNA 非常粘稠，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)，容易堵塞管路。

區(qū)分死細(xì)胞的方法

死細(xì)胞特性：細(xì)胞膜滲透性增強(qiáng)，失去膜完整性

（1）DNA 結(jié)合染料：PI、DAPI、7 -AAD、TO-PRO- 3 等 DNA 染料只會(huì)進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)胞，結(jié)合到細(xì)胞的 DNA 上, 圖三門 R3 中為 7 -AAD 陰性，即為活細(xì)胞。

（2）蛋白結(jié)合染料：結(jié)合細(xì)胞表面或膜內(nèi)的游離胺，活細(xì)胞弱陽，死細(xì)胞強(qiáng)陽?？梢杂迷诠潭?biāo)本中的，區(qū)分樣本固定細(xì)胞狀態(tài)。

四、要設(shè)立必要的對(duì)照

對(duì)于免疫熒光或流式細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)，由于操作步驟比較多，同時(shí)在分析結(jié)果時(shí)無法像 WB 那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識(shí)別，所以要得到一個(gè)可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照。對(duì)于熒光直標(biāo)抗體，我們建議使用抗體的同型對(duì)照，即與抗體同一個(gè)來源種屬的正常同型 IgG 作為對(duì)照，對(duì)樣品進(jìn)行平行染色，來確定抗體的染色是否特異。此外，我們還可以使用不表達(dá)目標(biāo)的細(xì)胞或組織作為陰性樣品對(duì)照。同時(shí)，為了確保所有組分都正常發(fā)揮作用，那些已知表達(dá)目標(biāo)的陽性對(duì)照也少不了。