實驗方法原理

細胞周期指細胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

 

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

 

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復制的原料，經(jīng)過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

實驗材料 細胞

試劑、試劑盒 BrdU甲醇冰醋酸Giemsa染液秋水仙素SSC檸檬酸三鈉NaCl

儀器、耗材 冰箱玻片水浴鍋鍋蓋紫外燈光學顯微鏡

實驗步驟

一、試劑配制

 

1.  BrdU配制

 

BrdU 10 mg加雙蒸水10 ml ，4℃下避光保存。

 

2.  2xSSC配制

 

NaCl 1.75 g，檸檬酸三鈉0.88 g，加水至100 ml，4℃保存。

 

二、細胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使終濃度為10 ug/ml。

 

三、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1 ug。

 

四、48小時后常規(guī)消化細胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

 

五、常規(guī)染色體制片。

 

六、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2xSSC 液，距紫外燈管6 cm處紫外照射30分鐘。

 

七、棄去2xSSC液，流水沖洗。

 

八、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

 

九、鏡檢100個分裂相，計一、二、三、四細胞期分裂指數(shù)。

 

十、計算

 

細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）

 

 

收起 

其他

一、細胞周期介紹

 

細胞周期（cell cycle)是指細胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段 。

 

1.  間期

 

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。

 

（1）G1期　　

 

此期長短因細胞而異。體內(nèi)大部分細胞在完成上一次分裂后，分化并執(zhí)行各自功能，此G1期的早期階段特稱G0期。在G1期的晚期階段，細胞開始為下一次分裂合成DNA所需的前體物質(zhì)、能量和酶類等。

 

（2）S期　　

 

S期是細胞周期的關鍵時刻，DNA經(jīng)過復制而含量增加一倍，使體細胞成為4倍體，每條染色質(zhì)絲都轉(zhuǎn)變?yōu)橛芍z點相連接的兩條染色質(zhì)絲。與此同時，還合成組蛋白，進行中心粒復制。S期一般需幾個小時。

 

（3）G2期　　

 

為分裂期做后準備。中心粒已復制完畢，形成兩個中心體，還合成RNA和微管蛋白等。G2期比較恒定，需用1～1.5小時。

 

2.  分裂期

 

細胞的有絲分裂（mitosis）需經(jīng)前、中、后，末期，是一個連續(xù)變化過程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。一般需1～2小時。

 

（1）.前期（prophase）染色質(zhì)絲高度螺旋化，逐漸形成染色體（chromosome）。染色體短而粗，強嗜堿性。兩個中心體向相反方向移動，在細胞中形成兩極；而后以中心粒隨體為起始點開始合成微管，形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質(zhì)的螺旋化，核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

 

（2）中期（metaphase）細胞變?yōu)榍蛐?，核仁與核被膜已*消失。染色體均移到細胞的赤道平面，從紡錘體兩極發(fā)出的微管附著于每一個染色體的著絲點上。從中期細胞可分離得到完整的染色體群，共46個,其中44個為常染色體,2個為性染色體。男性的染色體組型為46,XY，女性為46XX。分離的染色體呈短粗棒狀或發(fā)夾狀，均由兩個染色單體借狹窄的著絲點連接構(gòu)成。

 

（3）后期（anaphase）由于紡錘體微管的活動，著絲點縱裂，每一染色體的兩個染色單體分開，并向相反方向移動，接近各自的中心體，染色單體遂分為兩組。與此同時，細胞波拉長，并由于赤道部細胞膜下方環(huán)行微絲束的活動，該部縮窄，細胞遂呈啞鈴形。

 

（4）末期（telophase）染色單體逐漸解螺旋，重新出現(xiàn)染色質(zhì)絲與核仁；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡組合為核被膜；組胞赤道部縮窄加深，后*分裂為兩個2倍體的子細胞。

 

在體內(nèi)根據(jù)細胞的分裂能力可把它們分為三類：

 

①增殖細胞群，如造血干細胞，表皮與胃腸粘膜上皮的干細胞。這類細胞始終保持活躍的分裂能力，連續(xù)進入細胞周期循環(huán)。

 

②不再增殖細胞群，如成熟的紅細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞等高度分化的細胞，它們喪失了分裂能力，又稱終末細胞（end cell）。

 

③暫不增殖細胞群，如肝細胞、腎小管上皮細胞、甲狀腺濾泡上皮細胞。它們是分化的，并執(zhí)行特定功能的細胞，在通常情況下處于G0期，故又稱G0期細胞。在某種刺激下，這些細胞重新進入細胞周期。如肝部分切除術后，剩余的肝細胞迅速分裂。