實(shí)驗(yàn)方法原理

細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。

 

單個(gè)細(xì)胞的周期測定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

 

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。

實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞

試劑、試劑盒 BrdU甲醇冰醋酸Giemsa染液秋水仙素SSC檸檬酸三鈉NaCl

儀器、耗材 冰箱玻片水浴鍋鍋蓋紫外燈光學(xué)顯微鏡

實(shí)驗(yàn)步驟

一、試劑配制

 

1.  BrdU配制

 

BrdU 10 mg加雙蒸水10 ml ，4℃下避光保存。

 

2.  2xSSC配制

 

NaCl 1.75 g，檸檬酸三鈉0.88 g，加水至100 ml，4℃保存。

 

二、細(xì)胞生長至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使終濃度為10 ug/ml。

 

三、44小時(shí)加秋水仙素，使每ml中含0.1 ug。

 

四、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。

 

五、常規(guī)染色體制片。

 

六、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2xSSC 液，距紫外燈管6 cm處紫外照射30分鐘。

 

七、棄去2xSSC液，流水沖洗。

 

八、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

 

九、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)一、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。

 

十、計(jì)算

 

細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時(shí)）

 

 

收起 

其他

一、細(xì)胞周期介紹

 

細(xì)胞周期（cell cycle)是指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段 。

 

1.  間期

 

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。

 

（1）G1期　　

 

此期長短因細(xì)胞而異。體內(nèi)大部分細(xì)胞在完成上一次分裂后，分化并執(zhí)行各自功能，此G1期的早期階段特稱G0期。在G1期的晚期階段，細(xì)胞開始為下一次分裂合成DNA所需的前體物質(zhì)、能量和酶類等。

 

（2）S期　　

 

S期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵時(shí)刻，DNA經(jīng)過復(fù)制而含量增加一倍，使體細(xì)胞成為4倍體，每條染色質(zhì)絲都轉(zhuǎn)變?yōu)橛芍z點(diǎn)相連接的兩條染色質(zhì)絲。與此同時(shí)，還合成組蛋白，進(jìn)行中心粒復(fù)制。S期一般需幾個(gè)小時(shí)。

 

（3）G2期　　

 

為分裂期做后準(zhǔn)備。中心粒已復(fù)制完畢，形成兩個(gè)中心體，還合成RNA和微管蛋白等。G2期比較恒定，需用1～1.5小時(shí)。

 

2.  分裂期

 

細(xì)胞的有絲分裂（mitosis）需經(jīng)前、中、后，末期，是一個(gè)連續(xù)變化過程，由一個(gè)母細(xì)胞分裂成為兩個(gè)子細(xì)胞。一般需1～2小時(shí)。

 

（1）.前期（prophase）染色質(zhì)絲高度螺旋化，逐漸形成染色體（chromosome）。染色體短而粗，強(qiáng)嗜堿性。兩個(gè)中心體向相反方向移動(dòng)，在細(xì)胞中形成兩極；而后以中心粒隨體為起始點(diǎn)開始合成微管，形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質(zhì)的螺旋化，核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

 

（2）中期（metaphase）細(xì)胞變?yōu)榍蛐?，核仁與核被膜已*消失。染色體均移到細(xì)胞的赤道平面，從紡錘體兩極發(fā)出的微管附著于每一個(gè)染色體的著絲點(diǎn)上。從中期細(xì)胞可分離得到完整的染色體群，共46個(gè),其中44個(gè)為常染色體,2個(gè)為性染色體。男性的染色體組型為46,XY，女性為46XX。分離的染色體呈短粗棒狀或發(fā)夾狀，均由兩個(gè)染色單體借狹窄的著絲點(diǎn)連接構(gòu)成。

 

（3）后期（anaphase）由于紡錘體微管的活動(dòng)，著絲點(diǎn)縱裂，每一染色體的兩個(gè)染色單體分開，并向相反方向移動(dòng)，接近各自的中心體，染色單體遂分為兩組。與此同時(shí)，細(xì)胞波拉長，并由于赤道部細(xì)胞膜下方環(huán)行微絲束的活動(dòng)，該部縮窄，細(xì)胞遂呈啞鈴形。

 

（4）末期（telophase）染色單體逐漸解螺旋，重新出現(xiàn)染色質(zhì)絲與核仁；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡組合為核被膜；組胞赤道部縮窄加深，后*分裂為兩個(gè)2倍體的子細(xì)胞。

 

在體內(nèi)根據(jù)細(xì)胞的分裂能力可把它們分為三類：

 

①增殖細(xì)胞群，如造血干細(xì)胞，表皮與胃腸粘膜上皮的干細(xì)胞。這類細(xì)胞始終保持活躍的分裂能力，連續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)。

 

②不再增殖細(xì)胞群，如成熟的紅細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等高度分化的細(xì)胞，它們喪失了分裂能力，又稱終末細(xì)胞（end cell）。

 

③暫不增殖細(xì)胞群，如肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞。它們是分化的，并執(zhí)行特定功能的細(xì)胞，在通常情況下處于G0期，故又稱G0期細(xì)胞。在某種刺激下，這些細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。如肝部分切除術(shù)后，剩余的肝細(xì)胞迅速分裂。