實(shí)驗(yàn)方法原理 活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測(cè)定的熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。

實(shí)驗(yàn)材料 抗體血清

試劑、試劑盒 RPMI1640DPBS洗滌液固定液

儀器、耗材 玻璃管塑料管離心機(jī)顯微鏡

實(shí)驗(yàn)步驟

1.  制備活性高的細(xì)胞懸液（培養(yǎng)細(xì)胞系、外周血單個(gè)核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法）

　　　　　　　　　　　　　　　　

2.  用10 ％FCS RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106～1×107 /ml

　　　　　　　　

3.  取40 μl細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb（5～50 μl）的小玻璃管或塑料離心管，再加50 μl 1∶20（用DPBS稀釋）滅活正常兔血清，4 ℃ 30 min

　　　　　　　　

4.  用洗滌液洗滌2 次，每次加洗滌液2 ml左右，1000 rpm×5 min

　　　　　　　　　

5.  棄上清，加入50 μl工作濃度的羊抗鼠（或兔抗鼠）熒光標(biāo)記物，充分振搖，4 ℃ 30 min

　　　　　　　　　

6.  用洗滌液洗滌2 次，每次加液2 ml左右，1000 rpm×5 min

　　　　　　　　　　　　　　　　　

7.  加適量固定液（如為FCM制備標(biāo)本，一般加入1 ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細(xì)胞濃度加入100～500 μl固定液）

　　　　　　　　　　　　　

8.  FCM檢測(cè)或制片后熒光顯微鏡下觀察（標(biāo)本在試管中可保存5～7 天）

　　

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注意事項(xiàng)

1.  整個(gè)操作在4 ℃下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN3，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。

　　

2.  洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。

　　

3.  加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

　　

4.  細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。

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其他

一、附錄

　　

1.  DPBS （×10， 貯存液）

 

NaCl 80 g，KCl 2 g，蒸餾水加至1000 ml，Na2HPO4 11.5 g，臨用時(shí)用蒸餾水1∶10稀釋，KH2PO4 2 g

　　

2.  洗滌液

 

DPBS 900 ml，F(xiàn)CS 50 ml（終濃度5 ％），4 ％ NaN3 50 ml（終濃度0.2 ％）

　　

3.  固定液

 

DPBS 1000 ml，葡萄糖 20 g（終濃度2 ％），甲醛 10 ml，NaN3 0.2 g （終濃度0.02 ％）