描述一種大聚合酶鏈反應(PCR)應用的方法，使在已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知DNA成幾何級數(shù)擴增。用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的DNA，以產(chǎn)生適合于PCR 增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子。

PCR的引物同源于環(huán)上核心區(qū)的末端序列，但其方向性，使鏈的延長經(jīng)過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)。 這種反向PCR方法可用于擴增本來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應用于制備未知序列探針或測定邊側(cè)區(qū)域本身的上、下游序列。

引言

通常測定一個與已知序列相鄰的DNA序列是必要的，例如位于編碼DNA的上游和下游兩側(cè)的區(qū)域，轉(zhuǎn)位因子的插入位點以及克隆于Lambda、科期?；蚪湍溉斯と旧w載體上 的DNA片段末段的未知序列的探針等。這種末端特異探針在Southern Blot或染色體步查(Chromosome walking)所需的噬菌斑雜交或克隆雜交中都十分有用。

要得到邊側(cè)序列的探針一般需要進行一系列費時、費力的工作，首先用內(nèi)切酶裂解和用已知邊側(cè)序列的探針Southern雜交以確定大小適合于克隆的末端片段;這些片段還要經(jīng)過凝膠分離、克隆，得到的物質(zhì)再與已知邊側(cè)區(qū)域雜交以確定合適的克隆子。要測定未吞邊側(cè)區(qū)序列時，通常需要從克隆中進行各種片段的亞克隆。

為避免這些步驟，我們采用擴展的PCR方法，使相鄰邊側(cè)區(qū)域得以擴增。典型的PCR擴增使用與互補鏈雜交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向內(nèi)跨過兩個引物之間的區(qū)域。

一個引物的DNA合成產(chǎn)物作為另一個引物的模板，進行DNA變性、引物退火，DNA聚合酶管伸反應的多次重復性循環(huán)可使引物規(guī)定區(qū)域的拷貝數(shù)成指數(shù)增加。

但用傳統(tǒng)PCR方法得不到緊鄰引物外側(cè)的DNA序列，因為寡聚核苷酸所引導的既有目的DNA又有引物外側(cè)區(qū)的DNA合成在拷貝過程中只呈線性增長，這種線性增長是因為，對于每種引物來講，其不能引導DNA反向合成(3'-5')。

幾乎是同時，有三個實驗室分別設計出一種方法，使PCR可以擴增邊側(cè)區(qū)域。該方法 (反向PCR)的基本點是用適當內(nèi)切酶裂解核心區(qū)外分子，使這些酶切片段自身連接形成環(huán)狀分子，從而將邊側(cè)區(qū)域轉(zhuǎn)化為內(nèi)部區(qū)域。用與核心區(qū)末端同源的引物，但其3'端趄向未知區(qū)域，可以進步用PCR擴增環(huán)中的未知區(qū)域。

反向PCR程序

Ochman等，Triglia等[6]和Silver、Keerikatte[7]的文章中詳細地描述了反向PCR的不同應用，下面是Ochman等描述的方法概要。

用傳統(tǒng)的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3-4kb。在許多情況下，首先需要進行Southern雜交來確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端片段。

能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴增，并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類 型決定的接點(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。

對于擴增左翼或右翼序列，初試時 靠近識別上個堿基位位的酶，并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點。如果用反向PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入合適的酶切位點。

用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實驗中，為產(chǎn)生對反向 PCR大小適當?shù)腄NA片段需要兩種內(nèi)切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán)化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。

連接前，需用酚或熱變性使內(nèi)切酶失活。在我們實驗中，不必裂解環(huán)狀分子核心區(qū)也可得到有效的PCR擴增。(這顯然 不同于Silver和Keerikatter[7]的實驗結(jié)果，他們報道在核心裂解使模板線性化后， PCR擴增率增加100倍，但Triglia[5]等則發(fā)現(xiàn)裂解環(huán)狀分子與加熱引起隨機缺口效果相同)。

聚合酶鏈反應條件與經(jīng)典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進行30個循環(huán)?？筛淖働CR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向 PCR用于測序時，與核心區(qū)末端后部結(jié)合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增部分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點更近，減少了擴增引物的干擾。