描述一種大聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)應(yīng)用的方法，使在已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知DNA成幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增。用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切裂解含核心區(qū)的DNA，以產(chǎn)生適合于PCR 增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子。

PCR的引物同源于環(huán)上核心區(qū)的末端序列，但其方向性，使鏈的延長(zhǎng)經(jīng)過(guò)環(huán)上的未知區(qū)而不是分開(kāi)引物的核心區(qū)。 這種反向PCR方法可用于擴(kuò)增本來(lái)就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應(yīng)用于制備未知序列探針或測(cè)定邊側(cè)區(qū)域本身的上、下游序列。

引言

通常測(cè)定一個(gè)與已知序列相鄰的DNA序列是必要的，例如位于編碼DNA的上游和下游兩側(cè)的區(qū)域，轉(zhuǎn)位因子的插入位點(diǎn)以及克隆于Lambda、科期?；蚪湍溉斯と旧w載體上 的DNA片段末段的未知序列的探針等。這種末端特異探針在Southern Blot或染色體步查(Chromosome walking)所需的噬菌斑雜交或克隆雜交中都十分有用。

要得到邊側(cè)序列的探針一般需要進(jìn)行一系列費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的工作，首先用內(nèi)切酶裂解和用已知邊側(cè)序列的探針Southern雜交以確定大小適合于克隆的末端片段;這些片段還要經(jīng)過(guò)凝膠分離、克隆，得到的物質(zhì)再與已知邊側(cè)區(qū)域雜交以確定合適的克隆子。要測(cè)定未吞邊側(cè)區(qū)序列時(shí)，通常需要從克隆中進(jìn)行各種片段的亞克隆。

為避免這些步驟，我們采用擴(kuò)展的PCR方法，使相鄰邊側(cè)區(qū)域得以擴(kuò)增。典型的PCR擴(kuò)增使用與互補(bǔ)鏈雜交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向內(nèi)跨過(guò)兩個(gè)引物之間的區(qū)域。

一個(gè)引物的DNA合成產(chǎn)物作為另一個(gè)引物的模板，進(jìn)行DNA變性、引物退火，DNA聚合酶管伸反應(yīng)的多次重復(fù)性循環(huán)可使引物規(guī)定區(qū)域的拷貝數(shù)成指數(shù)增加。

但用傳統(tǒng)PCR方法得不到緊鄰引物外側(cè)的DNA序列，因?yàn)楣丫酆塑账崴龑?dǎo)的既有目的DNA又有引物外側(cè)區(qū)的DNA合成在拷貝過(guò)程中只呈線性增長(zhǎng)，這種線性增長(zhǎng)是因?yàn)?，?duì)于每種引物來(lái)講，其不能引導(dǎo)DNA反向合成(3'-5')。

幾乎是同時(shí)，有三個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別設(shè)計(jì)出一種方法，使PCR可以擴(kuò)增邊側(cè)區(qū)域。該方法 (反向PCR)的基本點(diǎn)是用適當(dāng)內(nèi)切酶裂解核心區(qū)外分子，使這些酶切片段自身連接形成環(huán)狀分子，從而將邊側(cè)區(qū)域轉(zhuǎn)化為內(nèi)部區(qū)域。用與核心區(qū)末端同源的引物，但其3'端趄向未知區(qū)域，可以進(jìn)步用PCR擴(kuò)增環(huán)中的未知區(qū)域。

反向PCR程序

Ochman等，Triglia等[6]和Silver、Keerikatte[7]的文章中詳細(xì)地描述了反向PCR的不同應(yīng)用，下面是Ochman等描述的方法概要。

用傳統(tǒng)的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴(kuò)增的片段的大小由 PCR擴(kuò)增片段的大小決定，目前，PCR擴(kuò)增的實(shí)際上限為3-4kb。在許多情況下，首先需要進(jìn)行Southern雜交來(lái)確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端片段。

能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向PCR只能擴(kuò)增引物所定模板(依賴(lài)于引物)的上游或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴(kuò)增，并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類(lèi) 型決定的接點(diǎn)(例如，互補(bǔ)突頭連接與鈍頭連接)。

對(duì)于擴(kuò)增左翼或右翼序列，初試時(shí) 靠近識(shí)別上個(gè)堿基位位的酶，并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點(diǎn)。如果用反向PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測(cè)雜交探針，建議事先在載體中引入合適的酶切位點(diǎn)。

用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實(shí)驗(yàn)中，為產(chǎn)生對(duì)反向 PCR大小適當(dāng)?shù)腄NA片段需要兩種內(nèi)切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán)化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。

連接前，需用酚或熱變性使內(nèi)切酶失活。在我們實(shí)驗(yàn)中，不必裂解環(huán)狀分子核心區(qū)也可得到有效的PCR擴(kuò)增。(這顯然 不同于Silver和Keerikatter[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，他們報(bào)道在核心裂解使模板線性化后， PCR擴(kuò)增率增加100倍，但Triglia[5]等則發(fā)現(xiàn)裂解環(huán)狀分子與加熱引起隨機(jī)缺口效果相同)。

聚合酶鏈反應(yīng)條件與經(jīng)典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)?？筛淖働CR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向 PCR用于測(cè)序時(shí)，與核心區(qū)末端后部結(jié)合的擴(kuò)增引物更為有用，它使測(cè)序引物擴(kuò)增部分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點(diǎn)更近，減少了擴(kuò)增引物的干擾。