實驗方法原理

堿裂解法是一種應用為廣泛的制備質粒DNA的方法，堿變性抽提質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會*分離，當以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調節(jié)其pH值至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質－SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。

 

簡明原理：堿裂解法是基于DNA的變性與復性差異而達到分離目的的。堿性使質粒DNA變性，再將pH值調至中性使其復性，復性的為質粒DNA，而染色體DNA不會復性，纏結成網狀物質，通過離心除去。

實驗材料 菌液

試劑、試劑盒 質粒抽提試劑盒RNase ABuffer S1Buffer S2Buffer S3Buffer W1Buffer W2 concentrateEluent

儀器、耗材 DNA 制備管 離心管移液槍槍頭槍頭盒離心機

實驗步驟

一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性

 

耗材：DNA 制備管，2 ml 離心管，1.5 ml 離心管。

 

RNase A：50 mg/ml，室溫保存。

 

Buffer S1：細菌懸浮液。加入RNase A 后，4℃ 貯存。

 

Buffer S2： 細菌裂解液，室溫密閉貯存。(若出現(xiàn)沉淀，應于37℃溫浴溶解并冷卻至室溫后再使用。）

 

Buffer S3：中和液，室溫密閉貯存。

 

Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。

 

Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前，根據(jù)瓶上數(shù)量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存?？捎?00%乙醇或95%乙醇。

 

Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室溫密閉貯存。

 

二、實驗準備

 

1.  次使用前，RNase A全部加入Buffer S1 中，4℃貯存。

 

2.  準備無核酸和核酸酶污染的Tip頭、離心管。

 

3.  次使用前，Buffer W2 concentrate中加入體積的無水乙醇。

 

三、操作步驟

 

1.  取1-4 ml 在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液（若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應減半或更少），12 000xg 離心1 min，棄盡上清。

 

2.  用250 ul 已加入RNase A 的Buffer S1 懸浮細菌沉淀，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊。

 

3.  加入250 ul Buffer S2，溫和并充分地上下翻轉混合4-6 次均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5 min。

 

4.  加入350 ul Buffer S3，溫和并充分地上下翻轉混合6-8 次，12 000xg 離心10 min。

 

步驟5～7 可以選擇負壓法或離心法純化質粒DNA。

 

A.  負壓法

.  將質粒DNA 制備管插到負壓裝置的接口上。吸取步驟4 中的離心上清并轉移到制備管中，開啟并調節(jié)負壓至-20-30 英寸汞柱，緩慢吸走管中溶液。

 

6A.  加500 ul Buffer W1，吸盡管中溶液。

 

7A.  加700 ul Buffer W2，吸盡管中溶液；以同樣的方法再用700 ul Buffer W2 洗滌一次。

 

* 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。

 

B. 離心法

 

5B.  吸取步驟4 中的離心上清并轉移到DNA 制備管（置于2 ml 離心管中），12 000xg 離心1 min。

 

6B.  將制備管置回離心管，加500 ul Buffer W1，12 000xg 離心1 min，棄濾液。

 

7B.  將制備管置回離心管，加700 ul Buffer W2，12 000xg 離心1 min， 棄濾液；以同樣的方法再用700 ul Buffer W2 洗滌一次。棄濾液。

 

* 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。

 

8.  將制備管置回2 ml 離心管中，12 000xg 離心1 min。

 

9.  將制備管移入新的1.5 ml 離心管中，在DNA 制備膜正中央加60-80 ul 水或Eluent，室溫靜置1 min。12 000xg 離心1 min。

收起 

注意事項

1.  Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時，要立即用大量清水或生理鹽水沖洗，必要時尋求醫(yī)療咨詢。

 

2.  本試劑盒為AxyPrep 質粒DNA小量試劑盒，適合于從1-4 ml 細菌培養(yǎng)物中提取多至20 ug 高純的質粒DNA。