1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測蜂蜜、動物組織（雞肉、豬肉、魚、蝦）、牛奶、奶粉和雞蛋等樣本中的氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolones，QNS），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的氟喹諾酮類藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗氟喹諾酮類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含氟喹諾酮類藥物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氟喹諾酮類藥物的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，45min～15min。

2.3 檢測下限：

喹諾酮類藥物檢測下限：

諾氟沙星……………………………………………0.2ppb

雙氟沙星……………………………………………0.2ppb

恩諾沙星……………………………………………0.2ppb

氟甲喹………………………………………………0.2ppb

沙拉沙星……………………………………………0.2ppb

達(dá)氟沙星……………………………………………0.2ppb

培氟沙星……………………………………………0.2ppb

環(huán)丙沙星……………………………………………0.3ppb

依諾沙星……………………………………………0.3ppb

氧氟沙星（消旋體）………………………………0.3ppb

左氧氟沙星…………………………………………0.3ppb

噁喹酸………………………………………………0.6ppb

樣本低檢測限：

組織（雞肉、豬肉、魚、蝦）………………………0.3ppb

蜂蜜 …………………………………………………0.4ppb

牛奶 …………………………………………………3ppb

奶粉 …………………………………………………6ppb

雞蛋 …………………………………………………3ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

恩諾沙星………………………………………………100%

諾氟沙星………………………………………………100%

雙氟沙星………………………………………………84%

氟甲喹…………………………………………………126%

沙拉沙星………………………………………………107%

達(dá)氟沙星………………………………………………110%

培氟沙星………………………………………………146%

環(huán)丙沙星……………………………110%

依諾沙星………………………………66%

氧氟沙星（消旋體）…………………58%

左氧氟沙星……………………………10%

噁喹酸…………………………………28%

洛美沙星………………………………4%

麻保沙星………………………………4%

2.5 樣本回收率：

組織……………………………………85%±15%

蜂蜜……………………………………85%±15%

牛奶……………………………………85%±15%

奶粉……………………………………85%±15%

雞蛋……………………………………85%±15%

3 試劑盒組成

3.1 酶標(biāo)板…………………………………96孔

3.2 標(biāo)準(zhǔn)液（綠蓋）：各1ml

    0ppb，0.1ppb，0.4 ppb，1.6ppb，6.4ppb，25.6ppb

3.3 高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb……………1ml

3.4 酶標(biāo)記物 (紅蓋)…………………………7ml

3.5 抗體工作液 (藍(lán)蓋)………………………7ml

3.6 底物液A (白蓋)…………………………7ml

3.7 底物液B(黑蓋)……………………………7ml

3.8 終止液(黃蓋)……………………………7ml

3.9 20X濃縮洗滌液(白蓋)…………………40 ml

3.10 5X復(fù)溶液(黃蓋)…………………………50 ml

3.11 說明書………………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：無水乙腈、正己烷、濃HCl

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

    實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.15M鹽酸溶液

    取5ml濃鹽酸，加入去離子水中定容到400ml。

配液2：樣本提取液

    量取10ml 0.15M鹽酸溶液（配液1）加入到90ml無水乙腈中混合均勻。

配液3：復(fù)溶液

    用去離子水將5×復(fù)溶液按1:4 體積比進(jìn)行稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

5.3 樣本前處理步驟：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.1 動物組織（雞肉、豬肉、魚、蝦）處理方法：

5.1.1 稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；

5.1.2 加入8ml樣本提取液（配液2），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

5.1.3 取2ml清澈上層有機(jī)相至潔凈干燥的10ml玻璃試管中，50-60℃水浴氮?dú)獯蹈桑?/p>

5.1.4 加入1ml正己烷，振蕩2分鐘，再加1ml復(fù)溶液（配液3），振蕩30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

5.1.5 去除上層正己烷，取下層水相50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：0.3ppb

5.2 蜂蜜處理方法：

5.2.1 取1.0±0.05g蜂蜜至10ml聚苯乙烯離心管中，加6ml樣本提取液（配液2），振蕩5分鐘，使其充分溶解；

5.2.2 加入3ml復(fù)溶液（配液3），加入11ml二氯甲烷，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘；

5.2.3 吸去上層，取下層有機(jī)相8ml至干燥溶器中，50℃水浴氮?dú)獯蹈桑?/p>

5.2.4 用1ml復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物，再加入正己烷1ml混合30秒，室溫3000轉(zhuǎn)/分以上，離心5分鐘；

5.2.5 去除上層取下層50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：0.4ppb

5.3 牛奶處理方法：

5.3.1 取25µl樣本液與475µl復(fù)溶液（配液4）混合，振蕩1分鐘，使其充分溶解；

5.3.2 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：3ppb

5.4 奶粉處理方法：

5.4.1 稱取0.5±0.02g均質(zhì)物至10ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml去離子水，振蕩，使其充分溶解；

5.4.2 取100µl樣本液與400µl復(fù)溶液（配液3）混合，振蕩1分鐘；

5.4.3 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：50    檢測下限：6ppb

5.5 雞蛋處理方法：

5.5.1 稱取1.0±0.02g均質(zhì)物至10ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml去離子水，振蕩，使其充分溶解；

5.5.2 取100µl樣本液與400µl復(fù)溶液（配液3）混合，振蕩1分鐘；

5.5.3 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：30    檢測下限：3ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實(shí)驗(yàn)開始前需：將20×濃縮洗滌液用去離子水按1:19稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)終止反應(yīng)后在10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以個標(biāo)準(zhǔn)（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝	A	×100%
	A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?/p>

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度的降低。不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液為稀硫酸，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效