波士頓大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院的Andrea Geisz和Miklós Sahin-Tóth開發(fā)出一種T7D23A基因敲入小鼠，以填補此領(lǐng)域的空白。這種小鼠攜帶陽離子胰蛋白酶原（T7亞型）的雜合p.D23A突變，為胰腺炎的研究和治療提供了出色的模型。

 

圖1. p.D23A突變對胰蛋白酶原T7亞型的影響

 

胰腺炎是因為胰蛋白酶的自身消化作用而引起的疾病，包括急性胰腺炎、復(fù)發(fā)性急性胰腺炎和慢性胰腺炎。這些疾病常常引起腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱等癥狀，但并沒有特異性療法。

 

以往的研究表明，編碼消化蛋白酶或其抑制劑的基因若發(fā)生突變，則往往會促進急性胰腺炎的發(fā)生，并逐漸發(fā)展成慢性胰腺炎。例如，PRSS1（陽離子胰蛋白酶原）、CTRC（胰凝乳蛋白酶C）以及SPINK1（Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑1）的致病突變通過刺激自發(fā)激活或干擾保護機制，從而促進胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化成有害的胰蛋白酶。

 

不過，基因突變引起的胰腺內(nèi)胰蛋白酶原自發(fā)激活具有直接致病作用，這雖然獲得了大量的遺傳和生化證據(jù)支持，但目前還缺乏適當動物模型的確認。更重要的是，動物模型的缺乏還阻礙了胰蛋白酶抑制劑的臨床前試驗。

 

為此，波士頓大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院（Henry M. Goldman School of Dental Medicine）的Andrea Geisz和Miklós Sahin-Tóth開發(fā)出一種T7D23A基因敲入小鼠，以填補此領(lǐng)域的空白。這種小鼠攜帶陽離子胰蛋白酶原（T7亞型）的雜合p.D23A突變，為胰腺炎的研究和治療提供了出色的模型。這項成果近日發(fā)表在《Nature Communications》上。

 

T7D23A基因敲入小鼠的開發(fā)

 

小鼠基因組包含20個胰蛋白酶原基因。之前的研究表明，只有四種胰蛋白酶原高水平表達，它們分別是：T7、T8、T9和T209亞型。其中，T7亞型占胰蛋白酶原總量的40-50%，并且與其他亞型相比自發(fā)激活更快，產(chǎn)生的胰蛋白酶水平也更高。

 

為了產(chǎn)生自發(fā)激活增加的T7突變體，研究人員在激活肽中引入了Ala突變，以取代Asp23（p.D23A）。為了在體外測試T7 p.D23A突變體的激活特性，他們純化了重組野生型和突變型T7胰蛋白酶原，并測定了自發(fā)激活。與野生型相比，p.D23A突變體的自發(fā)激活顯著增加了50倍，同時，其他胰蛋白酶激活和降解途徑不受影響。

 

之后，研究人員委托賽業(yè)生物（Cyagen）制備了T7D23A基因敲入小鼠，具體是通過C57BL/6胚胎干細胞中的同源重組將p.D23A突變引入小鼠基因組（圖1）。DNA測序表明，這些雜合小鼠在突變位點顯示出兩個高度相當?shù)姆澹砻饕吧秃屯蛔冃偷任换虻谋磉_水平相當。新的T7D23A品系未出現(xiàn)明顯的表型改變，并且正常繁殖。

 

T7D23A小鼠出現(xiàn)自發(fā)的急性和慢性胰腺炎

 

研究人員對T7D23A小鼠的胰腺形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)2-3周時是正常的，但4-5周時變化較大，而2個月后胰腺明顯變小。組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，T7D23A小鼠從第3周開始出現(xiàn)典型的急性胰腺炎，在4-5周出現(xiàn)得更加頻繁（~40%）。水腫破壞了緊密排列的組織結(jié)構(gòu)，大量炎性細胞浸潤，且小葉出現(xiàn)中心局部壞死（圖2）。

 

在4-5周時，研究人員發(fā)現(xiàn)超過一半的小鼠表現(xiàn)出明顯的疾病進展。它們的胰腺切片顯示出廣泛的再生指征，包括假管復(fù)合物出現(xiàn)、胰管擴張和彌漫性間質(zhì)纖維化，這些都是早期慢性胰腺炎的特征。從2個月開始并持續(xù)到6至12個月，脂肪開始在組織學(xué)圖像中占據(jù)主導(dǎo)地位，而炎性細胞和假管復(fù)合物的數(shù)量開始減少。在擴張胰管的周圍纖維化更普遍，有時還充滿嗜酸性物質(zhì)，這些是晚期慢性胰腺炎的特征。

 

圖2. T7D23A小鼠的胰腺組織學(xué)

 

之后，研究人員將T7D23A小鼠的胰腺重量與C57BL/6N對照小鼠進行比較，發(fā)現(xiàn)約40%的小鼠在4-5周齡表現(xiàn)出明顯增加。這種增加與組織切片上觀察到的水腫性急性胰腺炎一致。大約50%的小鼠在4-5周齡時胰腺重量明顯減輕，表明早期慢性胰腺炎的出現(xiàn)。所有T7D23A小鼠在2月、6月和12月齡時顯示出與晚期慢性胰腺炎相關(guān)的胰腺萎縮，與對照小鼠相比胰腺重量減輕約70%。

 

T7D23A小鼠的酶活檢測

 

淀粉酶是診斷急性胰腺炎常用的指標。因此，研究人員也測定了各個年齡的T7D23A小鼠血漿中的淀粉酶活性。在4-5周時，他們在約40%的小鼠中觀察到淀粉酶值偏高，這與之前的結(jié)果一致。不過，并非所有小鼠都能捕獲到急性胰腺炎的指標，這可能與采樣時間和發(fā)病年齡有關(guān)，也可能是小鼠在沒有急性發(fā)作的情況下患上慢性胰腺炎。

 

接著，他們以3周齡（無病理變化）、4周齡（急性或早期慢性胰腺炎）和2月齡（晚期慢性胰腺炎）T7D23A小鼠為對象，測定了新鮮制備的胰腺勻漿液中的胰蛋白酶活性。與相同年齡的對照小鼠相比，3周時未檢測到胰蛋白酶活性的升高，但在4周時檢測到高值。盡管功能性腺泡細胞減少，但在2個月時仍觀察到酶活的升高，表明胰腺內(nèi)胰蛋白酶的激活在整個疾病過程中持續(xù)存在。這些結(jié)果支持了，胰蛋白酶原的自發(fā)激活可引起急性胰腺炎發(fā)作，且隨后發(fā)展成慢性胰腺炎。

 

為了排除與胰蛋白酶原自發(fā)激活無關(guān)的疾病機制，研究人員還制備了p.D23A、K24G雙突變的小鼠品系，除了帶有雜合的T7D23A等位基因，胰蛋白酶原激活位點Lys24也經(jīng)過突變。這種小鼠在5.5個月時沒有出現(xiàn)自發(fā)的胰腺病理變化。這個結(jié)果提供了令人信服的證據(jù)，說明胰蛋白酶原錯誤折疊等機制并不引起T7D23A小鼠的表型。

 

T7D23A小鼠與人類胰腺炎的特征比較

 

研究人員認為，這種新模型概括了人類胰腺炎的臨床疾病特點，它總是先發(fā)展為急性胰腺炎，然后再發(fā)展為不可逆的慢性胰腺炎。不過，他們沒有觀察到人類經(jīng)常出現(xiàn)的急性病情反復(fù)發(fā)作。這種差異可能是由此處所用的胰蛋白酶原突變造成的。

 

研究人員認為，他們展示了一個慢性胰腺炎的臨床前小鼠模型，該疾病是由胰腺內(nèi)胰蛋白酶原自發(fā)激活的增加所驅(qū)動的。這個模型概括了人類慢性胰腺炎的顯著特征。值得一提的是，盡管T7D23A小鼠出現(xiàn)明顯的病理變化，但它們能夠正常繁殖并發(fā)育到成年期，這是臨床前應(yīng)用的先決條件。

 

“在概念層面，這個模型提供了直接的體內(nèi)證據(jù)，表明胰蛋白酶原的自發(fā)激活可驅(qū)動慢性胰腺炎的發(fā)作和發(fā)展，且治療方法應(yīng)針對胰腺內(nèi)的胰蛋白酶，”研究人員總結(jié)道。