熱擊法

 

實(shí)驗(yàn)方法原理 質(zhì)粒DNA或重組DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過42攝氏度短時(shí)間的熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒DNA 重組DNA

試劑、試劑盒

LB培養(yǎng)基 蒸餾水 IPTG X-gal 氨芐青霉素

儀器、耗材

旋渦混合器 微量移液取樣器 移液器吸頭 離心管 雙面微量離心管架 干式恒溫氣浴 恒溫水浴鍋 制冰機(jī) 恒溫?fù)u床 培養(yǎng)皿 超凈工作臺(tái) 酒精燈 玻璃涂棒 恒溫培養(yǎng)箱

實(shí)驗(yàn)步驟

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

 

1.  器材

 

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5 ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺(tái)，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。

 

2.  試劑

 

培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌ddH2O，IPTG，X-gal。

 

3.  材料處理

 

無菌ddH2O，1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

 

二、操作步驟

 

1.  事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。

 

2.  從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100 ul）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

 

3.   加入5 ul 連接好的質(zhì)?；旌弦海―NA含量不超過100 ng），輕輕震蕩后放置冰上20 min。

 

4.  輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5 min。

 

5.  在超凈工作臺(tái)中向上述各管中分別加入500 ul LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。

 

6.  在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液100-300 ul，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

 

7.  如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40 ul 2% X-gal，8 ul 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

 

8.  在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。

 

9.  在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

 

10.  觀察平板上長(zhǎng)出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。

注意事項(xiàng)

1. 電擊之前保持低溫狀態(tài)。

 

 

 

2.電擊杯使用完，用針頭蒸餾水反復(fù)沖洗杯底，再用70%乙醇浸泡，4℃存放，使用前烘干即可，或者烘干后，-20℃冰箱存放。

 

 

 

3.玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂。