組織及血液堿性磷酸酶（AKP/ALP）活性測(cè)定試劑盒說明書
微量法
產(chǎn)品說明：
AKP/ALP 是一種含鋅的糖蛋白酶，在堿性環(huán)境中可水解各種天然及人工合成的磷脂單酯化
合物。AKP/ALP 廣泛分布于人體各臟器中，以肝臟為主。在堿性環(huán)境中，AKP/ALP 催化磷酸苯
二鈉生成游離酚；酚與 4-氨基安替比林和鐵青化鉀反應(yīng)紅色亞醌衍生物，在 510nm 有特征光
吸收；通過測(cè)定 510nm 吸光度增加速率，來計(jì)算 AKP 活性。
自備儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液
器和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體×1 瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體×1 瓶，4℃避光保存。
試劑四：液體×1 瓶，4℃避光保存，未變成藍(lán)綠色之前均可使用。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 支（EP 管中），2 μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。
操作步驟：
一、粗酶液提?。?br />1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加
入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，4℃、10000rpm 離心 10min，取上清液待測(cè)。
2. 血液可直接測(cè)定，或者適當(dāng)稀釋后測(cè)定。
二、測(cè)定步驟：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 510nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min 以上。
3. 空白管：取 EP 管，加入 4μL 蒸餾水，40μL 試劑二，40μL 試劑三，混勻后置于 37℃水
浴中保溫 15min；加入試劑四 120μL，混勻后于 510nm 測(cè)定吸光度，記為 A 空白管。
4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 EP 管，加入 4μL 標(biāo)準(zhǔn)品，40μL 試劑二，40μL 試劑三，混勻后置于 37℃水
浴中保溫 15min；加入試劑四 120μL，混勻后于 510nm 測(cè)定吸光度，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。
5. 對(duì)照管： 取 EP 管，加入 40μL 試劑二，40μL 試劑三，混勻后置于 37℃水浴中保溫 15min；
加入試劑四 120μL，混勻；后加入 4μL 上清液，混勻后于 510nm 測(cè)定吸光度，記為 A
對(duì)照管。
6. 測(cè)定管：取 EP 管，加入 4μL 上清液，40μL 試劑二，40μL 試劑三，混勻后置于 37℃水
浴中保溫 15min；加入試劑四 120μL，混勻后于 510nm 測(cè)定吸光度，記為 A 測(cè)定管。
其中標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需做一管，測(cè)定管和對(duì)照管每個(gè)樣均需做
三、AKP/ALP 活性計(jì)算：
a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1. 血液中 AKP/ALP 活力計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 酚定義為一個(gè)活性單位。
AKP/ALP 活力(U/mL)= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總]
÷V 樣×V 樣總÷T=6.8×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
C 標(biāo)準(zhǔn)品：2μmol/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積（mL），1020μL=1.02 mL； V 樣：加入
反應(yīng)體系中上清液體積（mL），0.020mL；V 樣總：1mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），15 min。
2. 組織中 AKP/ALP 活性計(jì)算
（1）按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 酚。
AKP/ALP(U/mg prot)= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反
總]÷(Cpr×V 樣)÷T
= 6.8×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生 1 μmol 酚。
AKP/ALP(U/g )= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總]÷(V 樣
÷V 樣總×W)÷T
= 6.8×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)品：2μmol/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積（mL），205μL=0.205mL； Cpr：粗酶液
蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：
樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），0.004mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：
反應(yīng)時(shí)間（min），15 min。
b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1． 血液中 AKP/ALP 活力計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 酚定義為一個(gè)活性單位。
AKP/ALP 活力(U/mL)= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總]
÷V 樣×V 樣總÷T=6.8×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
C 標(biāo)準(zhǔn)品：2μmol/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積（mL），1020μL=1.02 mL； V 樣：加入
反應(yīng)體系中上清液體積（mL），0.020mL；V 樣總：1mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），15 min。
2. 組織中 AKP/ALP 活性計(jì)算
（1）按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 酚。
AKP/ALP(U/mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反
總]÷(Cpr×V 樣)÷T
=6.8×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr
活性單位定義：37℃中每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 酚。
AKP/ALP(U/g)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總]÷(V 樣
÷V 樣總×W)÷T
=6.8×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)品：2μmol/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積（mL），205μL=0.205mL； Cpr：粗酶液
蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：
樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），0.004mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：
反應(yīng)時(shí)間（min），15 min。
注意事項(xiàng)：
1. 試劑二、試劑三和試劑四均需避光保存。
2. 試劑四變藍(lán)綠色后不能再使用。
3. 加入試劑四后必須立即混勻，否則顯色不*。