線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量

試劑盒說明書

 微量法 100 管/96 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

MCA是線粒體三羧酸循環(huán)的一個中間產物，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成，

其含量是三羧酸循環(huán)強度的主要指標之一。

配合測定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 MCA 含量，

其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進行程度，（2）綜合分析丙

酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰 CoA 含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰

CoA 情況，（3）乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 MCA 含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進

行狀況。

測定原理：

MCA 在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進一

步與苯肼反應，生成相應的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在 330nm 處有吸收峰，該波長下吸光

度的變化程度可反映出 MCA 的含量。

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調式移液槍、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研缽、蒸

餾水。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

堿性提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 2mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 6mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保

存；

標準液：液體 1mL×1 支，10μmol/mL 檸檬酸標準液，4℃保存。

線粒體中檸檬酸提?。?/span>

稱 0.05~0.1g 樣品（建議稱 0.1g 樣本），加入 0.5mL 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃

離心 5min；取上清至另一 EP 管中，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取 300μL 該上清

液和 300μL 堿性提取液中和后可用于細胞質 CA 含量測定）；沉淀即線粒體，向沉淀中加

入 0.5mL 酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重

復 30 次），取此溶液 300μL 和 300μL 堿性提取液中和，混勻，置冰上待測（不可用于蛋

白質含量測定）。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30 min 以上，調節(jié)波長到 330nm，蒸餾水調零。

2、試劑一、二和三 37℃預熱 10min。

3、樣本測定：

空白管和標準管只需要各做一個。

試劑名稱(μL) 空白管 標準管 測定管

試劑一 60 60 60

蒸餾水 60

標準液 60

樣本 60

試劑二 20 20 20

試劑三 60 60 60

充分混勻，330nm 立即測定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2，ΔA=A2 –A1。

檸檬酸含量計算：

（1）按蛋白濃度計算

檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 標準管×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管)

×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）=10×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管)÷Cpr

蛋白質含量需要另外測定。

（2）按樣本鮮重計算

檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標準管×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標準管－ΔA空白管) ×V

樣]÷（W×V 樣÷V 樣總）=10×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管)÷W

C 標準管：標準液濃度，10μmol/mL； V 樣：加入反應體系中樣本體積：0.06mL；V 樣總：

加入提取液體積：1mL；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

注意：檢測限為 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鮮重。