一氧化氮（NO）硝酸還原酶法試劑盒

一氧化氮（NO）測(cè)定試劑盒說明書

一、測(cè)定意義：

NO 化學(xué)性質(zhì)活潑，體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為硝酸鹽（NO₃^-）和亞硝酸鹽（NO₂^-），血清(NO₃^-) 與(NO₂^{-)濃度之和（NO}₃^-┼NO₂^-）才能準(zhǔn)確代表體內(nèi) NO 水平。血清（NO₃^-┼NO₂^-）含量測(cè)定， 國(guó)內(nèi)有的單位采用金屬鎘還原法，但該法操作繁瑣（血清需除蛋白），反應(yīng)不易控制（金屬鎘可將 NO₂^¯進(jìn)一步還原），且不能*將 NO₃^-還原為 NO₂^¯，準(zhǔn)確性差。

本測(cè)試法為一種靈敏、簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定、易推廣的方法。二、測(cè)定原理：

NO 化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)為 NO₂^¯和 NO₃^¯，而 NO₂^¯又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為 NO₃^¯， 本法利用硝酸還原酶特異性將 NO₃^¯還原為 NO₂^¯，通過顯色深淺測(cè)定其濃度的高低。

三、試劑的組成與配制（25 管/24 樣 A012-1-1）：

試劑一：液體 6ml×1 瓶，-20℃以下保存 3 個(gè)月。用前放 37℃水浴或室溫使溶解后再用。試劑二：液體6ml×1 瓶，-20℃以下保存 3 個(gè)月。用前放 37℃水浴或室溫使溶解后再用。混合試劑的配制：按試劑一︰試劑二=1︰1 配制，用多少配多少，配好后充分混合后待用，

現(xiàn)用現(xiàn)配 24 小時(shí)內(nèi)有效。試劑三：液體6ml×1 瓶，室溫保存 6 個(gè)月。試劑四：液體 3ml×1 瓶，室溫保存 6 個(gè)月。

試劑五：粉劑×1 支，用時(shí)加 90℃～100℃熱雙蒸水 10ml [注 2],充分溶解，避光保存。

試劑六：粉劑×1 支，用時(shí)加雙蒸水 4ml，避光冷藏保存，當(dāng)顏色變成深咖啡色不可再用。試劑七：液體4ml×1 瓶，室溫保存 6 個(gè)月。

顯色劑的配制：需多少配多少。試劑五︰試劑六︰試劑七=2.5︰1︰1。若能在一個(gè)月內(nèi)用完者也可一次配成。剩余顯色劑置于盛雙蒸水的 40ml 方瓶中，避光保存。天冷會(huì)有結(jié)晶析出，再次使用時(shí)，放 100℃水浴，反復(fù)搖動(dòng)溶解后使用。

10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液：0.5ml×1 支，-20℃以下保存 6 個(gè)月。

100mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液的配制：取 0.1ml 10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用雙蒸水定容稀釋至

10ml（即 100 倍稀釋），混勻，即為 100mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

另附：配試劑五、試劑六及標(biāo)準(zhǔn)品的雙蒸水 40ml×1 瓶。

[注 1]：試劑五為過飽和溶液，所以在配制時(shí)用 90℃～100℃的熱雙蒸水 13ml（熱脹冷縮）邊隔水加熱邊用玻璃棒攪拌，以使其充分溶解。一次實(shí)驗(yàn)用不完再用時(shí)可能仍有結(jié)晶，用之前可以再次邊隔水加熱邊玻璃棒攪拌使其溶解。(隔水加熱：取干凈的小燒杯倒入試劑五，再加入 90℃～100℃ 的熱雙蒸水 13ml，再將此小燒杯放在另一有熱水的盆或鍋或燒杯中，注意千萬別把小燒杯中的試劑弄翻。這時(shí)用玻璃棒將小燒杯中的試劑攪拌溶解，試劑五溶液一次實(shí)驗(yàn)用不完再用時(shí)可能仍有結(jié)晶，用之前把盛有試劑五溶液的小燒杯放在另一有熱水的盆或鍋或燒杯中，注意千萬別把小燒杯中的試劑弄翻。這時(shí)用玻璃棒將小燒杯中的試劑攪拌溶解。)

一氧化氮（NO）硝酸還原酶法試劑盒

四、試劑的組成與配制（50 管/48 樣 A012-1-2）：

試劑一：液體 6ml×2 瓶，-20℃以下保存 3 個(gè)月。用前放 37℃水浴或室溫使溶解后再用。試劑二：液體6ml×2 瓶，-20℃以下保存 3 個(gè)月。用前放 37℃水浴或室溫使溶解后再用。混合試劑的配制：按試劑一︰試劑二=1︰1 配制，用多少配多少，配好后充分混合后待用，

現(xiàn)用現(xiàn)配 24 小時(shí)內(nèi)有效。試劑三：液體12ml×1 瓶，室溫保存 6 個(gè)月。試劑四：液體 6ml×1 瓶，室溫保存 6 個(gè)月。

試劑五：粉劑×1 支，用時(shí)加 90℃～100℃熱雙蒸水 20ml [注 1] ,充分溶解，避光保存。

試劑六：粉劑×1 支，用時(shí)加雙蒸水 8ml，避光冷藏保存，當(dāng)顏色變成深咖啡色不可再用。試劑七：液體8ml×1 瓶，室溫保存 6 個(gè)月。

顯色劑的配制：需多少配多少。試劑五︰試劑六︰試劑七=2.5︰1︰1。若能在一個(gè)月內(nèi)用完者也可一次配成。剩余顯色劑置于盛雙蒸水的 40ml 方瓶中，避光保存。天冷會(huì)有結(jié)晶析出，再次使用時(shí)，放 100℃水浴，反復(fù)搖動(dòng)溶解后使用。

10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液：0.5ml×1 支，-20℃以下保存 6 個(gè)月。

100mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液的配制：取 0.1ml 10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用雙蒸水定容稀釋至

10ml（即 100 倍稀釋），混勻，即為 100mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

另附：配試劑五、試劑六及標(biāo)準(zhǔn)品的雙蒸水 40ml×2 瓶。

[注 1]：試劑五為過飽和溶液，所以在配制時(shí)用 90℃～100℃的熱雙蒸水 23ml（熱脹冷縮）邊隔水加熱邊用玻璃棒攪拌，以使其充分溶解。一次實(shí)驗(yàn)用不完再用時(shí)可能仍有結(jié)晶，用之前可以再次邊隔水 加熱邊玻璃棒攪拌使其溶解。(隔水加熱：取干凈的小燒杯倒入試劑五，再加入 90℃～100℃ 的熱雙蒸水 23ml，再將此小燒杯放在另一有熱水的盆或鍋或燒杯中，注意千萬別把小燒杯中的試劑弄翻。這時(shí)用玻璃棒將小燒杯中的試劑攪拌溶解，試劑五溶液一次實(shí)驗(yàn)用不完再用時(shí)可能仍有結(jié)晶，用之 前把盛有試劑五溶液的小燒杯放在另一有熱水的盆或鍋或燒杯中，注意千萬別把小燒杯中的試劑弄翻。這時(shí)用玻璃棒將小燒杯中的試劑攪拌溶解。)

五、操作步驟： 一氧化氮（NO）硝酸還原酶法試劑盒

（一）、血清、胃液、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)液等標(biāo)本的檢測(cè)前處理。請(qǐng)參照《實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》：

	空 白 管	標(biāo) 準(zhǔn) 管	測(cè) 定 管
雙蒸水 (ml)	0.1
100μmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液 (ml)		0.1
樣本 (ml)			0.1
混合試劑 (ml)	0.4	0.4	0.4

混勻，37℃準(zhǔn)確水浴 60 分鐘

試劑三 (ml)	0.2	0.2	0.2
試劑四 (ml)	0.1	0.1	0.1

充分旋渦混勻 30 秒，室溫靜置 40 分鐘，3500～4000 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，取上清顯色。

上清(ml)	0.5	0.5	0.5
顯色劑 (ml)	0.6	0.6	0.6

混勻，室溫靜置 10 分鐘， 波長(zhǎng) 550nm，光徑 0.5cm, 雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值。

注意點(diǎn): 1、冬天測(cè)試時(shí)，所有的試劑均應(yīng)置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘。

 

2、取上清時(shí)，如果上清量不夠，請(qǐng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，或者少取一點(diǎn)。例如：可取 0.4 或 0.45ml，但您同一批實(shí)驗(yàn)所有的管子都應(yīng)取上清的量要一致，千萬不可將沉淀吸上。

（二）、組織樣本的檢測(cè)前處理，請(qǐng)參照《實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》：

	空 白 管	標(biāo) 準(zhǔn) 管	測(cè) 定 管
雙 蒸 水 (ml)	0.5	0.4
100μmol/L 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(ml)		0.1
樣本 (ml)			0.5
混合試劑 (ml)	0.4	0.4	0.4

混勻，37℃準(zhǔn)確水浴 60 分鐘

試劑三 (ml)	0.2	0.2	0.2
試劑四 (ml)	0.1	0.1	0.1

充分旋渦混勻 30 秒，室溫靜置 40 分鐘，3500～4000 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，取上清顯色。

上清(ml)	0.8	0.8	0.8
顯色劑 (ml)	0.6	0.6	0.6

混勻，室溫靜置 10 分鐘， 波長(zhǎng) 550nm，光徑 0.5cm，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值。

注意點(diǎn): 1、冬天測(cè)試時(shí)，所有的試劑均應(yīng)置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘。

2、取上清時(shí)，如果上清量不夠，請(qǐng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，或者少取一點(diǎn)。例如：可取 0.4 或 0.45ml，但您同一批實(shí)驗(yàn)所有的管子都應(yīng)取上清的量要一致，千萬不可將沉淀吸上。

六、注意點(diǎn)：

1、因組織中 NO 含量較少，組織勻漿一般為 10%或 20%，且做好的組織勻漿離心速度為 2500 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，轉(zhuǎn)速不可過高，時(shí)間不可太長(zhǎng)，樣本取樣量較大，以 0.3～0.5ml 左右為宜。

2、試劑一、試劑二和標(biāo)準(zhǔn)避免反復(fù)凍融，如果需要分批實(shí)驗(yàn)（3 次以上），可以在次實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑一、試劑二和標(biāo)準(zhǔn)分裝后再保存，根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)時(shí)的試劑用量取出待用。配好的顯色劑避光保存。

3、血清(漿)、組織等標(biāo)本如不馬上檢測(cè)，應(yīng)放于-70℃以下保存，半年內(nèi)有效。

4、所有配試劑的雙蒸水和空白管中加的雙蒸水均要用不含 NO ¯的雙蒸水或三蒸水。（試劑盒中配有雙蒸水）

5、在樣本與底物反應(yīng)完畢后，離心，取上清時(shí)千萬不可將沉淀吸出，否則吸光度會(huì)增高很多， 明顯影響結(jié)果的真實(shí)性。

6、試管的選擇:

①、用一次性塑料試管(建議使用我所的一次性塑料試管)或干凈的離心管；

②、若用玻璃管,清洗如下:先用洗滌劑泡半個(gè)小時(shí)以上，煮 0.5-1 個(gè)小時(shí)，洗刷后，用自

來水沖洗 15-20 遍，甩干，雙蒸水沖洗 1-2 遍，烘干。

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