錳過(guò)氧化物酶（Manganese peroxidase ，Mnp）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

錳過(guò)氧化物酶（EC1.11.1.13）是一種含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶，主要存在于擔(dān)子菌中，

屬于木質(zhì)素降解酶系，能有效的降解木質(zhì)素及廢水和土壤中比較難降解的氯化物，疊氮化合物、

DTT，多環(huán)芳烴等。

測(cè)定原理

錳過(guò)氧化物酶在Mn

2+存在的條件下，將愈創(chuàng)木酚氧化為四鄰甲氧基連酚，在465nm有特征吸

收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水

浴鍋。

試劑組成和配制

試劑一：液體 110mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 2mL×1 支，4℃保存。

試劑三：液體 4mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體 2mL×1 支，4℃保存。

酶液提取

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1mL試劑

一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g 離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10

4個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞

加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間 3min）；

然后 4℃，10000g 離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作

對(duì)照管 測(cè)定管

試劑一（μL） 120 100

試劑二（μL） 20

試劑三（μL） 40 40

樣品（μL） 20 20

試劑四（μL） 20 20

充分混勻，于30℃反應(yīng)10min，于微量石英比色皿/96孔板，測(cè)定465nm處吸光值，記為A對(duì)照管

和A測(cè)定管，△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管

酶活計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/mg prot）=△A÷ε÷d×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 83×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/g）=△A÷ε÷d×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T= 83×△A÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10

4個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/10

4cell）=△A÷ε÷d×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 83×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/L）=△A÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T= 8.3×10

4×△A

ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；

V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；

W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，10min

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/mg prot）=△A÷ε÷d×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 166×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/g）=△A÷ε÷d×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T= 166×△A÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10

4個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/10

4cell）=△A÷ε÷d×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 166×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/L）=△A÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T= 1.66×10

5×△A

ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)總體積，

1mL；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，

mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，10min