NADPH-細(xì)胞色素 C 還原酶（NCR）活性測(cè)定試劑盒說明書

 微量法 100 管/96 樣

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

細(xì)胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其

是藥物和毒物的代謝。NCR 作為 P450 酶系的重要一員，催化氧化型 P450 還原再生。

測(cè)定原理：

NCR 催化 NADPH 還原氧化型細(xì)胞色素 C，還原型細(xì)胞色素 C 在 550nm 處有特征吸收峰；

通過測(cè)定 550nm 吸光度的增加速率，來計(jì)算 NCR 活性。

自備儀器和用品：

普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔

板和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：粉劑×2 瓶，4℃保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加 100mL 蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 管，-20℃保存。臨用前配制，加 1.04 mL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前配制，加 1100 μL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約 0.5g 組織，加入 4℃預(yù)冷的 1 mL 試劑一，冰上充分研磨，

10 000g 4℃離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1 mL 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g

離心 30min，棄上清液。

4、終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測(cè)。

NADPH-細(xì)胞色素 C 還原酶測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 550 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

3. 空白管：取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 蒸餾水、180μL 試劑二、10μL 試劑

三和 10μL 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 和第 130s 吸光

值?！鰽 空白管=A2-A1。

4. 測(cè)定管：取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 提取液、180μL 試劑二、10μL 試劑

三和 10μL 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 和第 130s 吸光

值。△A 測(cè)定管=A4-A3。

注意：空白管只需做一次。

NCR 活性計(jì)算公式公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞色素 C 為 1 個(gè)酶活

單位。

NCR ((nmol/min /mg prot)= (△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

= 550×(△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

 

活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞色素 C 為 1 個(gè)酶活單

位。

NCR ((nmol/min/g)= (△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

=275×(△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑（cm），

1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），210μL=2.1×10-4

L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），

需要另外測(cè)定；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），10μL=0.01mL；V 樣總：提取液

體積，0.5 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min 。

b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞色素 C 為 1 個(gè)酶活

單位。

NCR ((nmol/min/mg prot)= (△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

= 1100×(△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞色素 c 為 1 個(gè)酶活單位。

NCR ((nmol/min/g) = (△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

= 550×(△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：96 孔板光徑（cm），

0.5cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），210μL=2.1×10-4

L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），

需要另外測(cè)定；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），10μL=0.01mL；V 樣總：提取液

體積，0.5mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min 。

注意事項(xiàng)：

試劑三、試劑四臨用前配制，配好未使用完的 4℃可保存兩天。