紅霉素-N-脫甲基酶（ERND）活性測定試劑盒說明書

 微量法 100T/48S

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

細胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的酶系，在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物的

代謝，具有重要作用。ERND 在 P450 酶系中相當(dāng)于 CYP2B 亞型，與藥物代謝的去甲基化

密切相關(guān)。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產(chǎn)物而具有解毒作用，也可使

某些藥物經(jīng) CYP2B 代謝活化。

測定原理：

ERND 催化紅霉素釋放甲醛，通過 Nash 比色測定甲醛含量，即可計算出 ERND 活性。

自備儀器和用品：

普通離心機，超速離心機、可調(diào)式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔

板、蒸餾水和冰。

試劑組成和配置：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 100mL 蒸餾水溶解。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前加 1mL 蒸餾水，充分溶解。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 0.5mL 蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前，加蒸餾水 4.5mL 充分溶解。

試劑六：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑七：液體×1 瓶，4℃保存。

標準液：液體×1 瓶，-20℃保存。臨用前取 1.5mL EP 管，加入 10μl 標準液，加 990μl 蒸餾

水，混勻即為 0.05 mmol/L 標準甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、除去細胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織，加入 1mL 試劑一，冰上充分研磨，

10 000g 4℃離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)入超速離心管中。

2、粗制微粒體：100 000g，4℃，離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1mL 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g

離心 30min，棄上清液。

4、終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5mL，充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。該

待測液需當(dāng)天使用。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3. 對照管：取 0.5mL EP 管，加入 10μL 粗酶液，170μL 試劑二，10μL 試劑三，10μL 蒸餾

水，混勻后置于 37℃水浴保溫 30min；立即加入 35μL 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min；取

出后加入 35μL 試劑六，混勻后室溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min；取新的 EP 管，加

入 100μL 上清液，100μL 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，

于 412nm 測定光吸收，記為 A 對照管。

4. 測定管：取 0.5mL EP 管，加入 10μL 粗酶液，170μL 試劑二，10μL 試劑三，10μL 試劑

四，混勻后置于 37℃水浴保溫 30min；立即加入 35μL 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min；取

出后加入 35μL 試劑六，混勻后室溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min；取新 EP 管，加入

 

100μL 上清液，100μL 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于

412nm 測定光吸收，記為 A 測定管。

5. 標準管：取 0.5mL EP 管，加入 100μL 標準品，100μL 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，

然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測定光吸收，記為 A 標準管。

注意：每個樣品都需要做對照管。

ERND 活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按照蛋白濃度計算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×

稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V 樣）÷T

= 45×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷Cpr。

(2). 按照樣本質(zhì)量計算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/g) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍

數(shù)÷（W×V 樣）÷T

= 45×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷W

C 標準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標準品：100μL=1×10-4

L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上

清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另

外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W：樣品質(zhì)量，g；V 樣：加入粗酶

液體積，10μL=0.01mL；T：催化反應(yīng)時間（min），30min。

b.使用 96 孔板測定的計算公式如下

(1). 按照蛋白濃度計算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×

稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V 樣）÷T

= 45×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷Cpr。

(2). 按照樣本質(zhì)量計算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

ERND 活性(nmol/min/g) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍

數(shù)÷（W×V 樣）÷T

= 45×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷W

C 標準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標準品：100μL=1×10-4

L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上

清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另

外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W：樣品質(zhì)量，g；V 樣：加入粗酶

液體積，10μL=0.01mL； T：催化反應(yīng)時間（min），30min。