高壓液相色譜

Martin 和 Synge在1941年就提出高效相色譜的設想，然而直到六十年代后期，由于各種技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜才付諸實現(xiàn)。這種色譜技術(shù)曾被稱為高速液相色譜（HighSpeed Liquid Chromatography），高壓液相色譜（High Parss-ure Lipuid Chromatography），目前使用多的名稱是高效液相色譜（High Pe-rformance Liauid Chromatography，HPLC）。高效液相色譜已經(jīng)廣泛地應用，成為一項*的技術(shù)。它的主要優(yōu)點是⑴分辯率高于其它色譜法；⑵速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成；⑶重復性高；⑷高效相色譜柱可反復使用；⑸自動化操作，分析精，確度高。根據(jù)分離過程中溶質(zhì)分子與固定相相互作用的差別，高效液相色譜可分為四個基本類型，即液－固色譜、液－液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。高效液相色譜在生物領(lǐng)域中廣泛用于下列產(chǎn)物的分離和鑒定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有機酸；⑶甾體化合物；⑷生物鹼；⑸抗菌素；⑹糖類；⑺卟啉；⑻核酸及其降解產(chǎn)物；⑼蛋白質(zhì)、酶和多肽；⑽脂類等。
一、分類
高效液相色譜法可分為四個基本類型：即液－固色譜法，鍵合相色譜法，離子交換色譜法及體積排阻色譜法。
（一）液－固色譜法
液－固色譜法通常稱吸附色譜法，吸附劑有活性碳，氧化鋁和硅膠，在液－固色譜法中用的載體都是硅膠。硅膠對溶質(zhì)，分子的吸附能力不是平均分布在整個硅脫表面的，在硅膠表面有一些區(qū)域與溶質(zhì)分子強烈相互作用，這些區(qū)域為活性位置，硅膠與溶質(zhì)分子間主要作用是偶極距力氫鍵及靜電相互作用。極性越強，而化合物在硅膠柱上的滯留時間也長。在液－固色譜中，依靠流動相溶劑分子與溶質(zhì)分子競爭固定相互活性位置， 從而使溶質(zhì)從色譜柱上洗脫下來。與硅膠表面活性位置結(jié)合力強的溶劑洗脫溶質(zhì)分子的能力強，因而稱強溶劑，反之為弱溶劑。液─固色譜法的特點是適于分離色譜幾何異構(gòu)體，可用于脂溶性化合物質(zhì)如磷脂，甾體化合物，脂溶性維生素，前列腺素等。
（二）鍵合相色譜法
鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發(fā)展起來的。鍵合相色譜法將固定相共價結(jié)合在載體顆粒上，克服了分配色譜中由于固定相在流動中有微量溶解，及流動相通過色譜柱時的機械沖擊，固定相不斷損失，色譜柱的性質(zhì)逐漸改變等缺點。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。
1.正常相色譜法
在正常相色譜法中共價結(jié)合到載體上的基團都是極性基團，如一級氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動相溶劑是與吸附色譜中的流動相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性，因此流動溶劑的極性越強，洗脫能力也越強，即極性大的溶劑是強溶劑。固定相與流動相的這種關(guān)系正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動相中分配系數(shù)的不同進行分離，它不適于分離幾何異構(gòu)體。