本周小編將帶來IHC系列培訓(xùn)的，后一講，IHC實(shí)驗(yàn)中各種常見問題的原因分析和解決方案。希望通過本次課程，您可以了解到 IHC 實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)異常情況時(shí)您可采取的措施。

一、切片無染色 

IHC 中可能遇到的一個(gè)主要問題是無染色。出現(xiàn)這一問題的原因主要有三個(gè)：

• 蛋白表達(dá)量低/無表達(dá)

• 樣本制備不良

• 試劑/方案問題

1、表達(dá)量低/無表達(dá)

 

• 了解目標(biāo)蛋白表達(dá)的種屬特異性和組織特異性，有時(shí)候目標(biāo)蛋白在一些常見種屬(如：人)有表達(dá)，并不表示在其他種屬上也有表達(dá)。

解決方案：

• 在實(shí)驗(yàn)前查詢文獻(xiàn)，確定您待檢測的目標(biāo)種屬和組織的表達(dá)量情況；；

• 在實(shí)驗(yàn)方案中添加陽性對照組織樣本，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的正確性；

• 陽性對照的細(xì)胞系，一些情況下，可以選擇確定會(huì)表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞系作為陽性對照；

• 質(zhì)量優(yōu)良的抗體說明書上會(huì)給出建議的陽性對照樣本，可以作為參考。

圖1、人體不同組織的表達(dá)分布，來源：

2、樣本制備不良

• 固定步驟：過度固定組織或固定時(shí)間不夠；固定時(shí)使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑可能會(huì)遮蔽抗體識(shí)別的表位。

解決方案：

• 用不同的抗原修復(fù)方法暴露表位（用 pH 6 或 pH 9 緩沖液熱修復(fù)、酶修復(fù)等）。

• 如果過度固定，則需要縮短固定時(shí)間。

• 可能脫蠟不充分

解決方案：

• 延長脫蠟時(shí)間，且需要使用新鮮二甲苯。

 

圖2 、不同修復(fù)液對染色效果的影響

3、試劑/方案問題

• 一抗問題：

• 濃度太低：按照說明書上的建議，梯度稀釋抗體后實(shí)驗(yàn)，選擇合適的濃度。

• 孵育時(shí)間不夠：嘗試在 4°C 孵育更長時(shí)間（例如過夜）。

• 抗體可能不適用于IHC應(yīng)用，因?yàn)槠淇赡軣o法識(shí)別蛋白質(zhì)的天然（3D）構(gòu)象。

檢查抗體數(shù)據(jù)表，查看其是否在 IHC 中得到了驗(yàn)證及其 IHC 的類型（石蠟切片、冰凍切片等）?？贵w在免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）或免疫沉淀（IP）中的成功使用暗示了抗體能夠識(shí)別蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。

• 二抗問題：

• 使用的二抗為抗一抗宿主的抗體（例如，如果在兔中生產(chǎn)一抗，則使用抗兔二抗）。檢查一抗的亞型是否被二抗識(shí)別。

• 用其他蛋白的一抗檢測二抗效果，確保二抗正常使用。

二、高背景

免疫組化染色之后的高背景是困擾很多實(shí)驗(yàn)者的常見現(xiàn)象，如果您遇到類似問題，可以對照下表的分析，嘗試相應(yīng)的解決方案。

可能的問題原因	解決方案
沒有封閉或封閉不足	增加封閉時(shí)間，考慮更換封閉劑。如果使用血清，Abcam 推薦使用二抗種屬來源的正常血清（10%）封閉 1 小時(shí)。 試用商業(yè)化封閉緩沖液。 另一種選擇是嘗試預(yù)吸附二抗。
一抗?jié)舛瓤赡苓^高	滴定抗體至濃度，進(jìn)一步稀釋抗體并在 4℃ 孵育（緩慢孵育，但有針對性地結(jié)合效果）。
孵育溫度可能過高	4°C 下孵育切片。
二抗可能是非特異性結(jié)合	使用不加一抗只加二抗的對照。 如果您只看到二抗非特異性染色，請更換二抗，或者使用預(yù)吸附二抗。
組織沖洗不充分，仍殘留固定劑	所有步驟之間用 PBS 充分沖洗。
內(nèi)源性過氧化物酶具有活性	用酶抑制劑，使用左旋咪唑 (2 mM) 抑制堿性磷酸酶，或用H2O2(0.3% v/v) 抑制過氧化物酶。
檢測系統(tǒng)是熒光顯微鏡，固定過程引起自發(fā)熒光	福爾馬林/PFA 通常在綠色光譜中出現(xiàn)自發(fā)熒光，因此可試用在紅光譜內(nèi)的熒光基團(tuán)。 如果您有紅外檢測系統(tǒng)，可以使用紅外范圍內(nèi)的熒光基團(tuán)。
信號(hào)擴(kuò)增過多（間接技術(shù)）	減少擴(kuò)增孵育時(shí)間，稀釋二抗或擴(kuò)增試劑盒試劑。
應(yīng)用過多底物（酶檢測）	更大倍數(shù)稀釋底物，減少底物孵育時(shí)間。
色原與組織樣本中PBS 反應(yīng)（酶檢測）	在與底物孵育前使用 Tris 緩沖液清洗切片。
通透破壞細(xì)胞膜并去除膜蛋白（膜蛋白）	更換通透劑（如用 Tween® 20 代替 Triton™ X-100） 使用不含通透劑的緩沖液。

三、非特異性染色

非特異性染色也是小編在日常工作中被問到頻率較高的問題，希望下面這些建議一次性解答您的各種疑問。

• 一抗/二抗?jié)舛瓤赡苓^高。

• • 嘗試降低抗體濃度和/或縮短孵育期?？梢耘c不表達(dá)靶蛋白的陰性組織進(jìn)行比較。

• 內(nèi)源性過氧化物酶具有活性。

• • 用酶抑制劑，使用左旋咪唑 (2 mM) 抑制堿性磷酸酶，或用 H₂O₂ (0.3% v/v) 抑制過氧化物酶。

• 一抗是抗染色組織來源物種的抗體（例如在小鼠組織樣本上使用小鼠一抗）。當(dāng)應(yīng)用二抗時(shí)，其與組織樣本結(jié)合，因?yàn)槠錇榭乖摲N屬抗體。

• • 使用的一抗為針對與您組織來源物種不同物種的抗體。

  • 使用商業(yè)化試劑盒（例如，mouse on mouse 試劑盒：ab127055)。

• 切片/細(xì)胞已經(jīng)干燥。

• • 將切片/細(xì)胞保持在高濕度下以防變干。

總結(jié)

您現(xiàn)在應(yīng)該已經(jīng)*了解了 IHC 的常見疑難問題知識(shí)，包括：

1、切片無染色的原因及解決方法；

2、遇到高背景染色結(jié)果時(shí)的處理方案；

3、排除非特異性染色時(shí)的做法。

希望您通過這次系列培訓(xùn)了解所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)知識(shí)，使您可以順利完成所有實(shí)驗(yàn)。IHC 的培訓(xùn)到這里就結(jié)束了。請務(wù)必把這些信息保存在安全的地方，以備日后參考。