GB/T 19915.4—2005
豬鏈球菌 2 型三重 PCR 檢測(cè)方法
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬鏈球菌2型莢膜基因（cps2）、溶菌酶釋放蛋白基因（mrp）和 orf2這三個(gè)毒力基因的三重 PCR 檢測(cè)技術(shù)。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于由豬鏈球菌 2 型致病基因和致病菌株的檢測(cè)。 2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的 。新版本。凡是不注日期的引用文件，其。新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)
GB/T 6682—1992 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 3 術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3.1
豬鏈球菌 2 型 Streptococcus suis type 2
豬鏈球菌是屬于鏈球菌屬的一種細(xì)菌，根據(jù)其莢膜多糖抗原的差異，可分為1～34 及1/2共 35個(gè)血清型。豬鏈球菌2型是豬鏈球菌的一個(gè)血清型，不僅對(duì)豬致病性很強(qiáng)，而且可以感染特定的人群，是一種重要的人畜共患病病原菌。 4 測(cè)定方法
4. 1 方法提要
挑取可疑細(xì)菌培養(yǎng)物菌落，加入PCR反應(yīng)管中，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物，與標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記比較，來(lái)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。 4.2 試劑和材料
除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合 GB/T 6682—1992的滅菌雙蒸水。 4.2.1 cps2、mrp和orf2 的上下游引物，按合成說(shuō)明書(shū)使用。 4.2.2 Tag DNA 聚合酶。 4.2. 3 瓊脂糖∶電泳級(jí)。 4.2.4 溴化乙錠。
4.2.5 分子量標(biāo)記∶DL-2000。
4.2.6 TE緩沖液∶10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH 8.0）。
4.2.7 10×PCR緩沖液∶100 mmol/LKCl，160 mmol/L（NH，）2SO，20mmol/L MgSO，，200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),1% TritonX-100,1 mg/mL BSA。
4.2.8 電泳緩沖液∶242gTris堿，57.1mL冰乙酸，100 mL0.5 mol/L EDTA（pH8.0），加蒸餾水至 l O00 mL，使用時(shí) 10 倍稀釋。
4.2.9 加樣緩沖液∶0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖。
4.2.10 陽(yáng)性對(duì)照豬鏈球菌2型 HA9801 株基因組 DNA 模板，陰性對(duì)照馬鏈球菌獸疫亞種 ATCC 35246 株和金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 株基因組 DNA 模板。

4.2.11 豬鏈球菌2型三重 PCR反應(yīng)混合物。 4.3 儀器和設(shè)備 4.3.1 離心機(jī)。 4.3.2 DNA熱循環(huán)儀。 4.3.3 核酸電泳儀。 4.3.4 pH計(jì)，

4.3.5 移液器∶10μL、20μL、100μL、1 000μL。 4.3.6 紫外線透射儀或凝膠成像系統(tǒng)。 4.3.7 恒溫水浴鍋。 4.4 PCR 操作步驟

4.4.1 陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照 DNA 模板的提取

分別將豬鏈球菌 2 型 HA9801、馬鏈球菌獸疫亞種 ATCC 35246株和金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 株接種于5%犢牛血清 Todd-Hweitt 肉湯培養(yǎng)基，37℃搖振培養(yǎng)18h，用革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌柱離心式基因組 DNA 小量抽提試劑盒提取 DNA 模板，—20℃保存?zhèn)溆谩?4.4.2 PCR 擴(kuò)增

用鉑金耳釣取血平板上的可疑單菌落至含有豬鏈球菌2型三重 PCR反應(yīng)混合物的 PCR管中，混勻，加入 Taq 酶（2 U/μL）0.7μL，2000 r/min離心10 s，立即進(jìn)行 PCR擴(kuò)增;同時(shí)設(shè)去離子水的空白對(duì)照、豬鏈球菌2型 HA9801株基因組 DNA 模板的陽(yáng)性對(duì)照、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246 和金黃色葡萄球菌 ATCC 25923株基因組 DNA模板的陰性對(duì)照。擴(kuò)增條件為∶94℃預(yù)變性5min;94℃30s， 55℃30 s，72℃40 s，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min，4℃保存。 4. 4.3 瓊脂糖凝膠電泳

在電泳緩沖液中加入1%瓊脂糖，加熱融化后加入溴化乙錠制備凝膠，凝固后進(jìn)行電泳。8μL酶切產(chǎn)物加入2 μL5×上樣緩沖液，混勻后加入上樣孔，80 V 恒壓電泳 20 min，紫外線透射檢測(cè)。 5 結(jié)果及判斷 5.1 試驗(yàn)結(jié)果成立條件

陽(yáng)性對(duì)照 HA9801 株經(jīng) PCR擴(kuò)增出現(xiàn)約 858 bp、387 bp和 316 bp三條條帶，去離子水的空白對(duì)照、馬鏈球菌獸疫亞種 ATCC 35246 和金黃色葡萄球菌ATCC 25923 株基因組 DNA模板的陰性對(duì)照 PCR 產(chǎn)物電泳后沒(méi)有條帶，試驗(yàn)結(jié)果成立，否則，結(jié)果不成立。 5.2 結(jié)果判斷

瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外線投射下檢測(cè)，在空白和陰、陽(yáng)性對(duì)照成立的情況下，待檢樣品只出現(xiàn) 387bp一條條帶，可判定為豬鏈球菌2型;待檢樣品出現(xiàn)約387bp、316bp和858bp三條條帶，或出現(xiàn) 387bp和858bp兩條條帶，可判定為豬鏈球菌2型致病菌株;待檢樣品只出現(xiàn)858bp一條條帶，可判定為非豬鏈球菌 2 型的致病菌;待檢樣品不出現(xiàn)條帶，結(jié)果為陰性。 6 廢棄物處理和防止污染的措施

檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物，應(yīng)收集后高壓滅菌處理。

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