1   方法來源

1.1  進(jìn)出口食品中霍亂弧菌檢測方法(SN/T 1022-2010)

1.2  衛(wèi)生部《霍亂防治手冊》第六版(2013年)

 

2   適用范圍

   本程序規(guī)定了食品中霍亂弧菌（Vibrio cholera）的檢驗(yàn)方法。本程序適用于食品中霍亂弧菌的檢驗(yàn)。

 

3   設(shè)備和材料

   除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

3.1  恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1 ℃。

3.2  恒溫培養(yǎng)箱：41.5℃±1℃。

3.3  冰箱：2℃～5℃。

3.4  恒溫水浴箱：36℃±1℃。

3.5  均質(zhì)器或無菌乳缽。

3.6  天平：感量0.1 g。

3.7  無菌試管：18 mm×180mm、15mm×100mm。

3.8  無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。

3.9  無菌錐形瓶：容量250mL、500 mL、1000mL。

3.10 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。

3.11 微生物生化鑒定系統(tǒng)。

3.12 無菌手術(shù)剪、鑷子。

 

4  培養(yǎng)基和試劑

4.1 堿性蛋白胨水：見附錄A中A.1。

4.2 硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂：見附錄A中A.2。

4.3 4號瓊脂：見附錄A中A.3。

4.4 慶大霉素瓊脂：見附錄A中A.4。

4.5 商品化生化鑒定試劑：見附錄A中A.5。

 

5  檢驗(yàn)程序

6.  操作步驟

6.1  樣品處理

稱取25g樣品放入盛有225mL堿性蛋白胨水的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置于盛有225mL堿性蛋白胨水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。如無均質(zhì)器，則將樣品放入無菌乳缽中磨碎，然后放在500mL的滅菌容器內(nèi)，加225mL堿性蛋白胨水，并充分振蕩。

如為冷凍產(chǎn)品,應(yīng)在45℃以下不超過15 min,或2 ℃～5℃不超過18h解凍。

6.2  一次增菌

將深凍樣品、干品、腌漬產(chǎn)品于36℃±1℃培養(yǎng)6h～8h，新鮮樣品41.5℃±1℃培養(yǎng)6h～8h（如無明顯的細(xì)菌生長現(xiàn)象則繼續(xù)培養(yǎng)，但不能超過20 h）。

6.3  二次增菌

同時(shí)吸取上述一次增菌的表層增菌液0.2mL，加入10mL堿性蛋白胨水管中，36℃±1℃培養(yǎng)6 h～8 h。

6.4  分離

6.4.1 在所有顯示生長的一、二次增菌管中用接種環(huán)沾取一環(huán)表層增菌液，分別于TCBS（或科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基）平板、4號瓊脂（或慶大霉素瓊脂）平板上劃線分離。于36℃±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。

6.4.2 各種平板上霍亂弧菌的典型菌落特征見表1。

表1 霍亂弧菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

選擇性瓊脂平板	霍亂弧菌
TCBS	圓形、邊緣半透明而中央不透明、表面光滑的黃色菌落，直徑約3 mm左右。
科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基	藍(lán)色，藍(lán)綠色到綠色菌落。
4號瓊脂培養(yǎng)基	圓形、半透明、光滑濕潤、灰黑色水滴樣菌落，直徑約3 mm左右。
慶大霉素瓊脂平板	略帶青灰色、半透明、扁平、微隆起、光滑濕潤。如延長培養(yǎng)時(shí)間或室溫放置到48h， 菌落略帶黃色，中心形成黑色金屬碲沉淀。

 

6.4.3 純培養(yǎng)

每個(gè)平板上各挑取5個(gè)或以上可疑菌落（少于5個(gè)全部挑?。?，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面（或平板），36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

6.5  初步鑒定

6.5.1 氧化酶試驗(yàn)

挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，霍亂弧菌為陽性。

6.5.2 粘絲試驗(yàn)

挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行粘絲試驗(yàn)，霍亂弧菌為陽性。

6.5.3 涂片鏡檢

將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)?；魜y弧菌為革蘭氏陰性，呈弧形、逗點(diǎn)狀等多形態(tài)，無芽胞。

6.5.4 挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃

±1℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果?；魜y弧菌在三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色變黃。

6.6  確定鑒定

初步鑒定結(jié)果相符者用微生物生化鑒定系統(tǒng)或商品化生化鑒定試劑進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。

6.7  血清鑒定分型

6.7.1 血清鑒定

自營養(yǎng)瓊脂斜面上挑取純培養(yǎng)物與O1群及O139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗(yàn)。玻片凝集用血清的效價(jià)一般應(yīng)為1：40～1：50。如可疑菌落在血清中很快（一般在10 s內(nèi)）出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集，在生理鹽水中不凝集者判為陽性。均不凝集方可報(bào)告未檢出O1群及O139群霍亂弧菌。

6.7.2 O1群霍亂弧菌血清分型

上述確定為O1群霍亂弧菌的培養(yǎng)物，分別使用小川型及稻葉型單價(jià)血清做玻片凝集，同時(shí)做生理鹽水對照。

6.8  報(bào)告

當(dāng)檢出的可疑菌落生化學(xué)性狀符合表1要求，同時(shí)與霍亂弧菌診斷血清凝集（生理鹽水不凝集），報(bào)告25g（mL）樣品中檢出霍亂弧菌?；魜y弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別見表2。

表1 霍亂弧菌的生化性狀

表2 霍亂弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別

 

名稱

氧 化 酶

賴 氨 酸

精 氨 酸

鳥 氨 酸

明 膠

脲 酶

V ︱ P

42 ℃ 生 長

蔗 糖

D ︱ 纖 維 二 糖

乳糖

阿 拉 伯 糖

D ︱ 甘 露 糖

D ︱ 甘 露 醇

O N P G

嗜鹽性試驗(yàn)NaCl含量（％）

0

3

6

8

1 0

副溶血性弧菌

＋

＋

－

＋

＋

V

－

＋

－

V

－

＋

＋

＋

－

－

＋

＋

＋

－

創(chuàng)傷弧菌

＋

＋

－

＋

＋

－

－

＋

－

＋

＋

－

＋

V

＋

－

＋

＋

－

－

溶藻弧菌

＋

＋

－

＋

＋

－

＋

＋

＋

－

－

－

＋

＋

－

－

＋

＋

＋

＋

霍亂弧菌

＋

＋

－

＋

＋

－

V

＋

＋

－

－

－

＋

＋

＋

＋

＋

－

－

－

擬態(tài)弧菌

＋

＋

－

＋

＋

－

－

＋

－

－

－

－

＋

＋

＋

＋

＋

－

－

－

河弧菌

＋

－

＋

－

＋

－

－

V

＋

＋

－

＋

＋

＋

＋

－

＋

＋

V

－

弗氏弧菌

＋

－

＋

－

＋

－

－

－

＋

－

－

＋

＋

＋

＋

－

＋

＋

＋

－

梅氏弧菌

－

＋

＋

－

＋

－

＋

V

＋

－

－

－

＋

＋

＋

－

＋

＋

V

－

霍利斯弧菌

＋

－

－

－

－

－

－

nd

－

－

－

＋

＋

－

－

－

＋

＋

－

－

注：nd表示未試驗(yàn)；V表示可變。

 

7.  毒力基因檢測

如鑒定結(jié)果為霍亂弧菌，需進(jìn)行ctxAB基因的檢測。注意：也可采用經(jīng)過驗(yàn)證的商品化試劑盒。

7.1  DNA模板的制備

取適量純培養(yǎng)菌落加入500μL滅菌dH2O中混勻，煮沸10min，15000×g離心3 min。取上清液儲(chǔ)存在-20℃直至使用。也可以用商業(yè)化的DNA提取試劑盒，按其說明提取制備DNA模板。

7.2  PCR擴(kuò)增

7.2.1 引物

可使用引物對5'-ATT TTG AGG TGT TCC ATG TG-3'和5'-ATA AAGCAGTCA GGT GGT CT-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物全長749bp。

7.2.2 陰、陽性對照設(shè)置

陰性對照(空白對照)以滅菌水作為PCR反應(yīng)的模板；

陽性對照采用含有檢測序列的DNA（或質(zhì)粒）作為PCR反應(yīng)的模板。

7.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

 

試劑	反應(yīng)體積
dH2O	12.8 μL
10× Buffer. MgCl2	2.0 μL
dNTPs	0.8 μL
混合引物	2.0 μL
模板	2.0 μL
Taq 酶	0.4 μL
總體積	i. μ
	L

7.2.4 PCR反應(yīng)程序               

 

預(yù)變性	94℃	5 min；
變性	94℃	30 sec，
退火	56℃	40 sec，
延伸	72℃	2 min，30個(gè)循環(huán)；
終延伸	72℃	7 min；
保存	8℃	——

 

7.2.5 電泳

用0.5.5c序制備1.5％的瓊脂糖凝膠（含EB或Goldview 0.5μg /mL）。取5μL產(chǎn)物點(diǎn)樣（可包括適量上樣緩沖液），用DNA分子量標(biāo)記物做參照，電壓100 V，電泳50 min（根據(jù)實(shí)驗(yàn)室儀器情況確定具體電泳條件）。使用凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行保存和分析。

7.3  結(jié)果判定

陰性對照未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶條件下，如待測樣品出現(xiàn)749 bp大小的擴(kuò)增條帶，則可判定該菌株攜帶ctxAB基因；未出現(xiàn)749bp大小的擴(kuò)增條帶，則可判定不攜帶ctxAB基因。

如果陰性對照出現(xiàn)條帶和/或陽性對照未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，本次待測樣品的結(jié)果無效，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)，并排除污染因素。