人類嗜T淋巴細胞病毒1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 產(chǎn)品及特點
人類嗜 T 淋巴細胞病毒 1 型（Human T-lymphotropic Virus 1 HTLV 1）是一種感染后可導致血癌或其他轉(zhuǎn)移癌的 RNA 病毒，在體內(nèi)主要感染 CD4+T淋巴細胞可引起成人 T 淋巴細胞白血病/淋巴瘤、HTLV 相關(guān)脊髓?。℉TLV-Iassociated myelopathy ， HAM/ 熱帶痙攣性下肢癱， tropical spasticparaparesis TSP）及色素層炎（uveitis），主要通過輸血、針頭、性行為、母子傳染。HTLV-I 病毒是愛滋病毒（HTLV-I) 的遠親，但 HTLV-I 和愛滋病的發(fā)生沒有任何關(guān)連。目前各捐血中心以酵素免疫法全面篩檢 HTLV-I 病毒。
本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的人類嗜 T 淋巴細胞病毒 1 型探針法熒光定量 RT-PCR 試劑盒，它具有下列特點：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)人類嗜 T 淋巴細胞病毒 1 型高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。
6.本產(chǎn)品只能用于科研。
成分 | 編號 | 十孔盒包裝 |
探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 190504a | 500μL（藍蓋） |
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探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 190504b | 100μL（紅蓋） |
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熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） |
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人類嗜 T 淋巴細胞病毒 1 型探針 | 15-87810yw | 100 μL（白蓋） |
法 qRT-PCR 引物混合液 | | |
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人類嗜 T 淋巴細胞病毒 1 型 | 15-87810pb | 50 μL（棕色管） |
qRT-PCR 探針 | | |
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人類嗜 T 淋巴細胞病毒 1 型探針 | | |
法 qRT-PCR 陽性對照 | 60908-87810pc | 50 μL（黃蓋） |
(1×10E8 拷貝/μL) | | |
使用手冊 | 15-87810sc | 1 份 |
人類嗜T淋巴細胞病毒1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 使用方法
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
7.如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8.用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分 | | 陰性對照 | 樣品管 |
| N+2 個 | | |
| | 管 | （2-7 管） |
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探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
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探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
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人類嗜 T 淋巴細胞病毒 1 型 qRT- | 各 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
PCR 探針 | | | |
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人類嗜 T 淋巴細胞病毒 1 型探針 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
法 qRT-PCR 引物混合液 | | | |
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待測樣品 RNA 模板 | 各 5 μL | - | - |
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超純水 | - | 5 μL | - |
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| | | 各 5 μL（2 |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液 | - | - | 號樣到2號 |
（2-7 號） | | | 管，3 號樣到 |
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| | | 3 號管…） |
11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qRT-PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
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逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 30 min |
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預(yù)變性 | 94℃ | 10 min |
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qRT-PCR 反應(yīng) | 94℃ | 15 sec |
（40 個循環(huán)） | | |
| 60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的熒光信號） |
五、數(shù)據(jù)處理
12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。人類嗜T淋巴細胞病毒1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
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