法。目前，常用的細胞轉(zhuǎn)染方法主要分為三類途徑：物理介導(dǎo)（電穿孔法，基因槍法、顯微注射法）、化學介導(dǎo)（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法、陽離子聚合物介導(dǎo)法）、生物介導(dǎo)（病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染）。

 

理想細胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。目前實驗室常用的轉(zhuǎn)染方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，陽離子聚合物轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)染，不同的轉(zhuǎn)染方法各有利弊，針對細胞的習性和不同的實驗?zāi)康目蛇x擇相對合適的轉(zhuǎn)染方法。

 

一般來說，原代細胞轉(zhuǎn)染難度是比較大的，原代細胞研究具有非常重要的生物學意義，但是轉(zhuǎn)染效率低下一直是制約其發(fā)展的主要因素。

 

 

本文我們主要介紹一種常用的適用于原代細胞的轉(zhuǎn)染方法：脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法。

 

---陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時間一般不超過24小時。

 

常用的脂質(zhì)體主要有兩種，Lipofectin和Lipofectamine。前者是一種陽離子脂質(zhì)試劑，可與靶DNA的磷酸骨架結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物能輕易通過細胞膜從而完成轉(zhuǎn)染過程。Lipofectin可用于轉(zhuǎn)染DNA、RNA和寡核苷酸至各種動物細胞，并可將DNA導(dǎo)入植物原生質(zhì)體。Lipofectamine是一種多陽離子轉(zhuǎn)染試劑，其頭部具*的精胺基團，該基團的強負電子性使Lipofectamine具有較強的轉(zhuǎn)染能力。

 

 

實驗步驟

(一)貼壁細胞穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)染

1. 在六孔板或35mm培養(yǎng)皿中接種2ml(*培養(yǎng)基)約1.3×105細胞。

2. 37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)細胞至50-80％豐度。

3. 在兩個1.5ml離心管中準備如下溶液：

溶液A：溶1-2 μg DNA于100μl無血清培養(yǎng)基中

溶液B：溶2-25μl脂質(zhì)體(GIBCO BRL：LIPOFECTAMINETM Reagent)于100μl無血清培養(yǎng)基中

4. 將上述A、B兩液混合，室溫下放置15-45分鐘。此時可將細胞用2ml無血清培養(yǎng)基漂洗1-2遍。

5. 混合的A、B兩液中加入0.8ml無血清培養(yǎng)基，混勻，平鋪在漂洗過的細胞上。如果細胞對無血清耐受能力差，這一步可加入血清。但是在轉(zhuǎn)染過程中不要加入抗生素(antibiotic)。

6．37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2-24小時。

7. 加入lml培養(yǎng)基(含兩倍于正常濃度的血清)。若血清已加入，這一步可加入lml正常的*培養(yǎng)基。

8. 在轉(zhuǎn)染后的18-24小時換入新鮮的*培養(yǎng)基。

9．根據(jù)細胞類型及啟動子的活性，在24-72小時可對基因的表達活性進行分析。

10. 在轉(zhuǎn)染后的18-24小時，可將細胞按1:10傳入選擇培養(yǎng)基中進行篩選。

(二)瞬時轉(zhuǎn)染

1. 用無血清、無抗生素(antibiotic)的培養(yǎng)基漂洗細胞1-2遍。

2．在六孔板或35mm培養(yǎng)皿中接種0.8ml(無血清培養(yǎng)基)約2-3×106細胞。

3. 在兩個1.5ml離心管中準備如下溶液：

溶液A：溶1-2μgDNA于100μl無血清培養(yǎng)基中

溶液B：溶2-25μl脂質(zhì)體(GIBCO BRL：LIPOFECTAMINETM Reagent)無血清培養(yǎng)基中

4．將上述A、B兩液混合，室溫下放置15-45分鐘。

5．將混合液加入細胞懸液中，混勻，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2-24小時。

6．加入4ml*培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)24-72小時．

7．倒掉培養(yǎng)基，藍光激發(fā)下觀察綠色熒光。

 

 

 

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