羧酸酯酶（CarE）活性測(cè)定試劑盒操作步驟

                                               

                                                      分光光度法50管/48樣

 

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

哺乳動(dòng)物CarE，也稱脂族酯酶（aliesterase），廣泛分布于組織和器官，屬于絲氨酸水解酶家族。CarE催化含酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性物質(zhì)水解，但不能催化水解乙酰膽堿及其類似物。CarE參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝，并且與多種藥物、環(huán)境毒物以及致癌物的解毒和代謝有關(guān)，有機(jī)磷農(nóng)藥可結(jié)合并且抑制CarE活性。

 

測(cè)定原理：

CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固藍(lán)顯色；在450 nm光吸收增加速率，計(jì)算CarE活性。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

 羧酸酯酶（CarE）活性測(cè)定試劑盒操作步驟

試劑組成和配制：

試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體30mL×2瓶， 4℃保存；

試劑三：粉劑×2支， 4℃保存，臨用前取1支試劑三，加1.2ml無(wú)水乙醇充分溶解；

試劑四：粉劑×2支，-20℃保存，臨用前取1支試劑四，加少量試劑二溶解；

工作液配制：臨用前配制，向1瓶試劑二中，加入溶解后的試劑三和試劑四各1支，充分溶解，過(guò)濾，4℃避光保存，可用1周。

 

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞樣品制備

收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每200萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL試劑一，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；12000g 4℃離心30min，取上清液待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿；12000g 4℃離心30min，取上清液待測(cè)。

3、液體：直接測(cè)定。

 

測(cè)定步驟：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到450 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30 min。

3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入5μL蒸餾水和1000μL試劑二，迅速混勻，于450nm處測(cè)定3min內(nèi)吸光值變化，第10s吸光值記為A1，第190s吸光值記為A2。△A空白管=A2-A1

4. 測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入5μL上清液和1000μL試劑二，迅速混勻，于450nm處測(cè)定3min內(nèi)吸光值變化，第10s吸光值記為A3，第190s吸光值記為A4。△A測(cè)定管=A4-A3

 羧酸酯酶（CarE）活性測(cè)定試劑盒操作步驟

注意：空白管只需測(cè)定一次。

 

CarE活性計(jì)算公式：

1 組織中CarE活性

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活單位。

CarE酶活(U/mg prot)= (△A測(cè)定管-△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 67×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷Cpr

Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V樣：加入上清液體積，0.005 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3min。V反總：1.005mL；蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2） 按照樣品質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活單位。

CarE酶活(U/g 鮮重)= (△A測(cè)定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷W÷T

= 67×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷W

V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL；V反總：1.005mL；W：樣品質(zhì)量（g）；T：反應(yīng)時(shí)間（min），3min。

2 細(xì)菌或細(xì)胞中CarE活性

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活單位。

CarE酶活(U/10⁴ cell)= (△A測(cè)定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷細(xì)胞密度（10⁴ cell/mL）÷T

= 67×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷細(xì)胞密度（10⁴ cell/mL）

V總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL；V反總：1.005mL ；T：反應(yīng)時(shí)間（min），3min。

3. 液體中CarE活性

單位的定義：每毫升樣品在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活單位。

CarE酶活(U/mL )= (△A測(cè)定管-△A空白管) ×V反總÷V樣÷T

= 67×(△A測(cè)定管-△A空白管)

V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL；V反總：1.005mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），3min。

 

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