直接免疫熒光法測抗原

基本原理

將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。

試劑與儀器

l          磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

l          熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋

l          緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制

l          搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

l          有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）

l          熒光顯微鏡

l          玻片架

l          濾紙

l          37℃溫箱等。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。

2. 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其*覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間（參考：30min）。

3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。

4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。

5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：

（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。

注意事項(xiàng)

1. 對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。

2. 染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強(qiáng)染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時(shí)間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。

3. 為了保證熒光染色的正確性，試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。

（1）   標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。

（2）   特異性對照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。

（3）   陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。

如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。

4. 一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度會逐漸下降。

間接免疫熒光法測抗體

基本原理

染色程序分為兩步，步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。

試劑與儀器

l          磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

l          緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。

l          熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋 。

l          搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

l          有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）

l          熒光顯微鏡

l          玻片架

l          濾紙

l          37℃溫箱等。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。

2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。

3. 取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩 。

4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。

5. 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。

6. 重復(fù)操作3。

7. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。

8. 熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。

注意事項(xiàng)

1. 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過長 ，會使熒光減弱。

2. 每次試驗(yàn)時(shí) ，需設(shè)置以下三種對照：

（1）   陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物

（2）   陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物

（3）   熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物

3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。

4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。