實(shí)驗(yàn)方法原理    小腦顆粒神經(jīng)元的體外培養(yǎng)受取材部位、特殊培養(yǎng)條件等因素的影響，易于獲得純度較高的培養(yǎng)物。該細(xì)胞為雙極突起，常用來(lái)研究神經(jīng)突起的生長(zhǎng)。其培養(yǎng)條件具有高濃度鉀離子依賴(lài)特性，常用來(lái)作為誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的研究模型。當(dāng)成熟顆粒神經(jīng)元的培養(yǎng)液由高KCl(通常是25-30mmol/L)換為低KC!(基本培養(yǎng)液中已含5mmol/L KCl)時(shí)，細(xì)胞會(huì)逐漸發(fā)生凋亡。
實(shí)驗(yàn)材料    新生7d的SD大鼠仔鼠
試劑、試劑盒    10%胎牛血清+DMEMNeurobasal+B27KCl
儀器、耗材    培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟    
原代培養(yǎng)來(lái)自于新生7d的SD大鼠小腦顆粒神經(jīng)元，可參考Moreno-Flores的方法，此方法培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元純度達(dá)到95%以上。具體操作過(guò)程如下。

1.首先依照總論的方法獲得細(xì)胞懸液，然后在離心獲得的細(xì)胞沉淀中，加入少量的*培養(yǎng)液(Neurobasal+B27+25mmol/L KCl)重懸細(xì)胞，再根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果補(bǔ)加適的*培養(yǎng)液。根據(jù)培養(yǎng)目的按照合適的密度接種細(xì)胞于多聚賴(lài)氨酸包被的介質(zhì)上，37℃,5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)第4天1/2量換液，至第7天細(xì)胞基本成熟。小腦顆粒神經(jīng)元胞體小，接種后約24h,開(kāi)始伸出突起，突起易成束生長(zhǎng)。圖I-2示接種48h后細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

收起 
注意事項(xiàng)    
1.在原代取材時(shí)，由于取材部位和仔鼠體積的原因，通常將消過(guò)毒的仔鼠放置在100mm玻璃皿中，直接用解剖器械取出完整的小腦，不做斷頭處理。

2.小腦的腦膜不易剝離干凈，要特別仔細(xì)去除，否則培養(yǎng)物中成纖維細(xì)胞的污染難以去除。

3.由于培養(yǎng)細(xì)胞的目的不同，接種時(shí)的密度就有區(qū)別。如用于神經(jīng)突起觀察，可接種(1-3)x105/cm2的密度；如用于凋亡誘導(dǎo)的研究，可接種(4-6)x105/cm2的密度。

4.在做凋亡誘導(dǎo)時(shí)，通常將含高鉀的培養(yǎng)液全量換液為不含額外添加KCl的普通Neurobasal+B27培養(yǎng)液即可。按照核固縮判斷的方法，8h后凋亡的細(xì)胞數(shù)量可達(dá)40%左右。
收起 
其他    
1小腦顆粒神經(jīng)元胞體小，突起細(xì)長(zhǎng)，且容易成束生長(zhǎng)，個(gè)人感覺(jué)該細(xì)胞可做突起生長(zhǎng)的大致觀察，并不適合利用軟件分析突起長(zhǎng)短。神經(jīng)元一般3-4d突起就可長(zhǎng)好，可開(kāi)始觀察。

2.在體外培養(yǎng)7d左右待細(xì)胞成熟后，可以開(kāi)展凋亡實(shí)驗(yàn)。如添加保護(hù)劑抑制凋亡，應(yīng)注意誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則可能導(dǎo)致保護(hù)實(shí)驗(yàn)失敗。