EB病毒核酸檢測試劑盒PCR熒光探針法

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【產品名稱】
通用名稱：EB病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
【包裝規(guī)格】
24 人份/盒
【預期用途】本產品用于人體血清或血漿樣本中EB病毒核酸的定量檢測。
EB 病 毒（ epstein-barr virus,EBv ）， 又名 人皰 疹病 毒 4 型 。 EB 病 毒的感 染非常普 遍，主要通 過唾液感 染，我國 95%以上人 群在 3~5 歲 就已感 染了 EB 病毒 。在 一般 情況下 ，EB 病毒引 起的感染 是無癥狀的， 尤其 是兒 童時期 。 急 性的 EB 病毒 感染 ， 會引 起傳 染性單 核細胞 增多 癥， 伴有 急性呼吸道感 染、 發(fā)熱、 淋 巴結腫大、 肝 、 脾腫大等病 癥， 在兒童中 高發(fā)。當機體免 疫缺陷或免疫 系統(tǒng)處于抑制 狀態(tài)時，極易受
EB 病 毒 感染 ， 如 免疫 缺 陷 患 者、 T 細 胞 缺陷 患 者 、 移植后接受免 疫抑制治療常致嚴重的淋 巴 組 織 增生 性 疾 病 。 此 外 ， EB 病 毒 與 越 來越 多的人 類惡性腫瘤 有關，例如鼻 咽癌、霍奇金 淋巴瘤、非霍奇 金淋巴 瘤等。
實驗操作人員應接受過基因擴增或分子生物學方法檢測的專業(yè)培訓，具 備相關的實驗操作資格，實驗室應具備合理的生物安全防備設施及防護程序。
EB病毒核酸檢測試劑盒PCR熒光探針法【檢驗原理】
本產品選取 EB 病毒基因組 BamH1W 基因設計特異性引物和探針，在 樣本 DNA 核酸純化之后采用熒光 PCR 對病毒 DNA 進行檢測。
本產品采用煮沸裂解法提取病毒 DNA 模板，然后在 Taq 酶的作用下對
靶區(qū)域進行擴增，同時利用 Taqman 熒光探針技術實時監(jiān)測擴增產物的累積。 Taqman       探針帶有一個熒光發(fā)光基團和一個熒光淬滅基團，完整的探針在特定 光源激發(fā)下，發(fā)光基團所產生的熒光被淬滅基團全部吸收，樣品無熒光。PCR 過程中，Taq 酶在延伸 DNA 鏈的同時，可通過自身的 5’→3’核酸外切酶活性 降解與模板結合的特異性熒光探針，使熒光報告基團與淬滅基團分離，分離 后的熒光報告基團在特定光源激發(fā)下產生熒光。通過監(jiān)測整個 PCR 過程熒光 信號的變化，對未知模板進行定性分析。
同時本產品采用內標質控體系，用于監(jiān)測反應體系可能存在的抑制因 素。內標模板與靶基因無同源性，內標探針選擇的是與靶基因探針沒有沖突 的另一檢測通道。注：1）不同批號試劑盒中各組分不可以互換。
2）試劑盒以 外必需的設備 及材料： 試劑盒以外必需的設備及材料： 熒光定量 PCR 儀、旋渦混合器、生物安全柜、迷你離心機、干式恒 溫儀或 水 浴 鍋、 移液器及 無 菌吸 頭、離心機及 無 菌離 心 管、PCR 反應管、無粉乳膠手套。
儲存條件及有效期】
-20±5℃避光保存，有效期 6 個月。
開封后凍融不超過三次，穩(wěn)定保存不超過 2 個月。采用或干冰密封或 泡沫箱加冰密封運輸，運輸箱規(guī)格為 465×305×370cm，內置 7 個冰袋（750g）
+9kg 干冰。
生產日期及失效日期見標簽。
【適用儀器】
適用于 ABI 7500、Stratagene Mx3000P 熒光定量 PCR 儀。
【樣本要求】
1. 適用樣本類型：血清或血漿
2. 樣本采集:
2.1 血清 用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血 2ml，待 樣本自行析出血清后直接室溫 1600rpm 離心 5 分鐘分離出血清后轉移至 1.5ml 滅菌離心管中備用。
2.2 血漿 用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血 2ml，注 入含有 EDTA 的無菌收集管中，立即輕輕顛倒混勻，待樣本自行析出血漿后， 室溫 1600rpm 離心 5 分鐘分離出血漿后轉移至 1.5ml 滅菌離心管中備用。 3.樣本保存：
樣本收集后立即用冰塊保存或置于 4℃。樣本在 4℃保存不超過 72 小時，
-20℃條件下可以保存數(shù)月，長期保存請將樣本置于-70℃。 4 運輸：
運 輸 過 程 中 應 采 用 不 易 碎 的 容 器 裝 載 樣 本 ， 并 且 視 作 潛 在 的 傳 染 源，避免外 漏。采用冰或干冰密封 或泡沫箱加 冰密封運輸 ，避免樣 本運輸途 中解凍， 影響 檢測結果。
【檢驗方法】
1.樣本處理
1.1 樣本處理：
1）取 100µl 待檢樣本，加入 50µl 濃縮液，用漩渦振蕩器振蕩 15 秒混勻；
2）13,000rpm 離心 10 分鐘，小心吸出 150µl 上清液（盡量吸干上清液，但 不要觸及沉淀）并棄去，保存沉淀；
3）向離心管中加入 50µl 裂解液，然后用槍頭對準沉淀所在位置，將其挑離 管底，并反復吹打，用漩渦振蕩器振蕩將沉淀充分打散；
4）100℃溫浴 10 分鐘，13,000rpm 離心 10 分鐘后靜置待用。
1.2      定量標準品（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、陰性質控品和內標模板無需抽提，使用 前室溫融化混勻。
2.試劑配制
2.1 檢測反應設置陽性質控和陰性質控，每孔均設有內標以反映體系對 PCR
反應可能存在的抑制性。
2.2 配制過程
1) 提前 30 分鐘將試劑取出，室溫融化，短暫震蕩，離心數(shù)秒。
2) 確定反應數(shù) N，N=待檢樣本數(shù)（n）+質控品數(shù)（5）+1。計算加到反應 混合物中的各個試劑的量，計算如下3) 取 1.5ml 無菌離心管配置反應體系，試劑全部加入后震蕩混勻，離心數(shù)
秒。
4) 然后將上述混合液 23µl/管分裝至 PCR 反應管中。
3.加樣
取陰性質控品、定量標準品（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、臨床樣本 DNA 各 2µl
分別加入 PCR 反應管中，蓋緊管蓋（避免氣泡產生）短暫離心將管壁上的液 體全部甩至管底，然后立即進行 PCR 反應。
4.PCR 擴增程序設置
4.1ABI7500 Real-Time PCR System<Version 1.4 >
1) 打開軟件，默認首頁面的各選項后點擊 Next，進入 Select Detectors 對話 框選擇本次實驗所需的探針類型（如果供選欄內沒有可以新建）：靶基因探針 報告基團（Reporter）為 FAM，淬滅基團（Quencher）為 None；內標探針報 告基團為 HEX，淬滅基團為 None。在左邊一欄中選定探針類型后，點擊 Add 將 所 選 擇 的 探 針 加 入 到 右 欄 (Detectors in Document) 中 ， 右 上 角 passive reference 選擇 None。參數(shù)設置確認無誤后選擇 Next，進入 Setup Sample Plate 界面，然后點擊 Finish。
2) 進入 Setup 頁面后，按照本次實驗樣本在樣品盤上的實際位置，選取相 應孔位，并勾選對應的靶基因和內標模板探針類型。陰性質控品在“Task”一 欄選擇“NTC”；定量標準品（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）樣本“Task”一欄選擇“Standard”， 樣本“Task”一欄選擇“Unknown”。如果需要編輯樣品名，可直接點擊相應孔 位后錄入，確認后選擇 Finish。
3) 進入 Instrument 頁面，在此頁面中的熱循環(huán)參數(shù)控制面板（Thermal Cycle Protocol）內，設置所需的擴增程序（見下表），并根據實際情況輸入擴增體 積（Sample Volume）、選擇運行模式（Run Mode: Standard 7500），以及設定 收集熒光的步驟（Data Collection，黃色區(qū)域顯示）。確認無誤后，將結果保 存，點擊 Start 開始擴增檢測。
4.2Stratagene Mx3000P 型熒光定量 PCR 儀
1) 面板設置：雙擊“MxPro”圖標打開軟件，選擇 Quantitative PCR（Multiple Standards），點擊“OK” ；選中試劑所放的孔位，確認與儀器相對應，隨后在 “Well       type”的下拉選框里選擇相應的樣本類型：待測樣本選擇“Unknown”、 陰性質控品選擇“NTC”、定量標準品選擇“Standard”，在“Collect      fluorescence dat”內的“FAM”和“HEX”通道前劃“√”；依次選中每一個“Standard”（標準品） 孔，在“Standard      quantity”右側的選項框內依次選擇需要定量的通道“FAM”及 輸入相應的標準品濃度。
2) 反應條件設置：單擊進入“Thermal Profile Setup”頁面，在此頁面設置所 需的擴增程序（見下表），確認無誤后，將結果保存，點擊“RUN”開始擴增檢 測：
5. 結果分析條件的設定
5.1ABI 7500 Real-Time PCR System<Version 1.4 >
反應結束后，根據 PCR 儀說明書及熒光曲線進行手動或自動調整基線和閾 值?；€（baseline）的起始點（Start）一般設定在 5～8 之間，終止點（Stop）一般設定在 12～15 之間，閾值線（threshold）通常設定在 1000～5000 之間
（視具體情況而定）。將定量標準品對應的濃度輸入儀器軟件中，設定之后， 點擊分析（Analyse）按鍵，可以從 Reports 窗口得到各樣本的 Ct 值和相應的 初始濃度。
5.2Stratagene Mx3000P 型熒光定量 PCR 儀 反應結束后，根據熒光曲線進行手動或自動調整基線和閾值，手動調整基線 (Non-adaptive baseline)的起始點（Start）一般設定為 5～8，終止點（Stop）
一般設定為 12～15，閾值線（threshold fluorescence）通常設定在 500-2000 之間（視具體情況而定）。依次選中每一個“Standard”（標準品）孔，在“Standard quantity”右側的選項框內依次選擇需要定量的通道“FAM”及輸入相應的定量 標準品的濃度。設定之后，可以從“Text report”窗口得到各樣本的 Ct 值和相 應的初始濃度。
6. 質量控制
6.1 內標：用于監(jiān)測 PCR 反應中可能出現(xiàn)的抑制情況。HEX 通道應出現(xiàn) S
型曲線，Ct 值≤35。
6.2  陰性質控品： FAM 通道無 S 型曲線， 在 Reports 界面 Ct 一欄顯示
Undetermined；HEX 通道有 S 型曲線，且 Ct 值≤35.0。
6.3 定量標準品Ⅰ-Ⅳ：用作陽性質控及繪制標準曲線。FAM 通道有 S 型曲 線，且 Ct 值≤35。HEX 通道有 S 型曲線，且 Ct 值≤35.0。
6.4 標準曲線的相關系數(shù) |R| (|r|)  ≥ 0.99，或 R2 (r2)  ≥ 0.98。 以上條件必須在同一次實驗中全部滿足，否則本次實驗結果無效。
【參考值范圍】
待檢樣本測定值顯示＜1×103 copies/ml，則報告為“低于試劑盒zui低檢出 限(1×103 copies/ml）”，測定值在 1×103 copies/ml～5×103 copies/ml 之間的樣 本，直接報告所測定的數(shù)值，并注明“供參考”，測定值在 5×103 copies/ml～
5×108 copies/ml 之間的樣本，直接報告所測定的數(shù)值。參考值范圍由大量不 同濃度的線性參考品的檢測結果確定。
【檢驗結果的解釋】
1. 如果 HEX 通道沒有出現(xiàn) S 型曲線，檢測結果無效，應重新檢測。高濃度 樣本（Ct 值≤25），由于競爭抑制， HEX 通道無 S 型曲線屬于正常情況。
2. 如果 HEX 通道出現(xiàn) S 型曲線，同時 FAM 通道檢測無 S 型曲線，則檢測
報告為“低于試劑盒zui低檢出限（1×103        copies/ml）”。
3. 如果 HEX 通道出現(xiàn) S 型曲線，同時 FAM 通道檢測有 S 型曲線，則有如 下解釋：
3.1 如果待檢樣本測定值顯示＜1×103 copies/ml，則報告為“低于試劑盒zui低 檢出限(1×103 copies/ml）”。
3.2 測定值在 1×103 copies/ml～5×103 copies/ml 之間的樣本，直接報告所測
定的數(shù)值，并注明“供參考”。
3.3 測定值在 5×103 copies/ml～5×108 copies/ml 之間的樣本，直接報告所測 定的數(shù)值；
3.4 測定值大于 5×108copies/ml 的樣本，建議將樣本稀釋至線性范圍后重新 測定，并根據下面公式計算樣本濃度，結果注明為可報告數(shù)值。 可報告數(shù)值(zui終樣本濃度)=稀釋后濃度×稀釋倍數(shù)
稀釋倍數(shù)=(樣本量+稀釋液量)/樣本量
4 zui適樣本類型、感染類型及感染后的zui高病毒滴度時間未經驗證，因此， 在同一患者分次、多部位采集樣本可能會避免假陰性。
5 不合理的樣本采集、轉運及處理，樣本中的病毒滴度過低均有可能導致假 陰性結果。
6 病毒檢測靶序列的變異會導致假陰性結果。
7      本檢測結果僅供臨床參考，如需確診請結合臨床癥狀和其他檢測手段。
【檢驗方法的局限性】
1.    當樣本中被檢測核酸濃度低于zui低檢測限 1×103 copies/ml 時，可能會導致假陰性結果。

2. 擴增產物的污染和核酸提取中標本間的交叉污染，很容易出現(xiàn)假陽性結 果。因此，PCR 臨床應用必須要有嚴格的實驗室分區(qū)、實驗室管理和 質量控制措施。
3.    樣本中殘留的蛋白質成分對 PCR 擴增有抑制作用，在樣本處理的取上 清時應避免吸入白色沉淀物質。
【產品性能指標】
1 分析靈敏度：根據產品分析性能評估結果，本試劑盒的分析靈敏度為 1×103 copies/ml。
2 分析特異性：
a.對于可能存在檢測干擾的病原體：人巨細胞病毒、BK 病毒、JC 病毒、梅 毒、甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒Ⅰ型、單 純皰疹病毒Ⅱ型、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、皰疹病毒 6 型、皰疹病毒 7 型、
結核桿菌、人乳頭瘤病毒 HPV(6, 11, 16, 18)、沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲
原體、肺炎支原體（MP）、肺炎衣原體（CP）、腸道病毒 71 型（EV71）、柯 薩奇 a16 型(CA16)等病原體陽性樣本，本試劑盒檢測結果均為陰性。
b. 干擾物質：樣本中常見干擾物質高濃度的膽紅素（279.8μmol/L）、甘油三
酯（62.33 mmol/L）、血紅蛋白（167g/L）對 PCR 結果無明顯干擾。
3 精密度：同一批試劑對樣本進行 10 次重復檢測，檢測濃度對數(shù)值的變異 系數(shù) CV≤5%（n=10）。
4 線性檢測范圍：5×103 copies/ml~5×108 copies/ml。 5 臨床試驗：
臨床實驗結果顯示：本試劑盒的靈敏度為 99.52%，特異性為 98.08%。
【注意事項】
1. 實驗前請仔細閱讀本說明書。
2. 本品僅用 于體外診斷。
3. 使用本產品時，應遵循臨床基因擴增實驗室的技術規(guī)范進行操作。
4. 請自備移液器，振蕩器，離心機，無菌且?guī)V芯吸頭、離心管、PCR 反應管，及無粉一次性乳膠手套。
5. 樣本處理在生物安全柜內進行操作，防止污染環(huán)境和保護操作者。
6. 樣本操作和處理需符合相關法規(guī)要求：衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室 生物安全通用準則》和《醫(yī)療廢物管理條例》。
7. 實驗后的廢棄物品，如吸頭、擴增產物等需進行無害化處理后方可丟棄。
8.試劑盒中的陽性質控品是體外純化的質粒，無傳染性，但操作時應仍視為 傳染性物質進行處理。 
9.樣本核酸提取完畢后，建議立即進行檢測，否則請保存于-20℃，并且在24 小時內進行檢測。
10. 實驗完畢后使用 10%次氯酸或 75%乙醇處理操作臺面和移液器、離心 機、PCR 儀表面，然后紫外燈照射 25-30 分鐘。
11. 不同批號試劑盒中各組份不可以互換，請在有效期內使用本試劑盒，不
使用本試劑盒中的組分進行實驗可能會導致錯誤的結果。
【參考文獻】
1Ruiz G, Peña P, de Ory F et al. Comparison of commercial real-time PCR assays for quantification of Epstein-Barr virus DNA.J Clin Microbiol,2005 May;43(5):2053-7
2E. Leung,B.K. Shenton,G.Jackson et al.Use of real-time PCR to measure Epstein–Barr virus genomes in whole blood.Journal of Immunological Methods, 2002;270: 259–267
3 劉冬.小兒EB病毒感染臨床表現(xiàn)的多樣性.中外醫(yī)療，2010，29: 93-95