小鼠胚胎干細胞，E14

小鼠胚胎干細胞，E14是T25培養(yǎng)瓶直接發(fā)貨的形式。收到細胞后，拆開包裝T25瓶的自封袋，不拆封口膜，表面噴75%酒精消毒后顯微鏡觀察細胞狀態(tài)（有條件可以拍下此時細胞照片）。將細胞放入37度培養(yǎng)箱平衡兩小時以上，再處理細胞。首先將T25中培養(yǎng)基取出裝好備用，如細胞密度高于80%，可以直接消化傳代，相反則加入5-6mL培養(yǎng)基放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)即可。

生長特性：貼壁,懸浮,半懸浮半貼壁
培養(yǎng)條件:640+10%FBS+1%雙抗

溫度:37℃
空氣條件:5% CO2，,95% AIR
傳代方法:1:2傳代，2~3天換液
凍存條件:90%FBS+10%DMSO

小鼠胚胎干細胞，E14操作說明

請仔細閱讀本操作說明及相應(yīng)的細胞說明書。
收貨
<1>本公司的小鼠胚胎干細胞，E14發(fā)貨有四種形式：T25瓶、離心管、血清及干冰。
T25是用T25細胞培養(yǎng)瓶直接發(fā)貨的形式。收到細胞后，拆開包裝T25瓶的自封袋，不拆封口膜，表面噴75%酒精消毒后顯微鏡觀察細胞狀態(tài)（有條件可以拍下此時細胞照片）。將細胞放入37度培養(yǎng)箱平衡兩小時以上，再處理細胞。首先將T25中培養(yǎng)基取出裝好備用，如細胞密度高于80%，可以直接消化傳代，相反則加入5-6mL培養(yǎng)基放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)即可。
離心管是用15mL離心管發(fā)貨的方式，只用于懸浮細胞發(fā)貨。收到細胞后消毒處理及平衡參考上述T25瓶。平衡完成后，離心（1000rpm，3min）收集細胞，棄上清，用新的培養(yǎng)基重懸細胞并接種至培養(yǎng)瓶或皿中，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
血清是用牛血清直接發(fā)貨的形式，是細胞凍存管加入含有細胞的牛血清的形式。收到細胞后，拆開自封袋，凍存管表面噴75%酒精消毒后，在超凈臺中打開凍存管，將細胞用1mL槍頭輕輕幾次以將細胞吹勻，接種至含有預(yù)熱的培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或皿中，顯微鏡下觀察細胞是否吹勻，如果沒有吹勻，繼續(xù)吹勻至3-5個細胞一團，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
干冰是用本公司凍存液凍存細胞后，直接用干冰將凍存的細胞冷凍發(fā)貨的形式。收到細胞后按照細胞復(fù)蘇的步驟操作即可。
<2>相關(guān)問題
如不能在收到后及時操作細胞，T25及離心管發(fā)貨的細胞可以消毒后在37度過夜，血清發(fā)貨的細胞可以在室溫下靜置1-2天（注意不要放冰箱），干冰發(fā)貨的可以在確認(rèn)干冰未*升華時將細胞直接放回液氮或者-80度冰箱，若干冰*升華，請即刻復(fù)蘇細胞。
T25瓶及離心管在培養(yǎng)箱平衡是為了讓細胞盡快適應(yīng)培養(yǎng)箱環(huán)境，同時使部分因運輸導(dǎo)致脫落的細胞貼壁，此步驟非常必要。T25瓶如果在顯微鏡下可以看到部分不貼壁的細胞，可以收集上清后離心（1200rpm，5min）后，將沉淀用新的培養(yǎng)基重懸后接種至新的培養(yǎng)瓶或皿中。
部分細胞在運輸過程中，由于不斷震蕩及環(huán)境不適，可能導(dǎo)致細胞破碎死亡，從而使培養(yǎng)基中漂浮很多細胞碎片及顆粒狀物質(zhì)。這種情況下，平衡后，貼壁細胞用PBS洗兩遍在加新的培養(yǎng)基培養(yǎng)或者傳代至新瓶中培養(yǎng)即可；懸浮細胞可以離心（1000rpm，3min）收集細胞，并用PBS重懸后再離心一次，再用新的培養(yǎng)基重懸并接種細胞。

細胞培養(yǎng)及傳代
<1>細胞培養(yǎng)
細胞請于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大部分細胞是37℃，5% CO2，濕度100%環(huán)境下培養(yǎng)的。有極少部分細胞培養(yǎng)條件不*，請仔細閱讀相應(yīng)的細胞說明書，使用正確的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；
細胞于培養(yǎng)瓶或皿中培養(yǎng)，加入適量說明書上標(biāo)注的細胞相應(yīng)*培養(yǎng)基（一般液面高度2-3mm即可）。
<2>細胞傳代（以下步驟適用于10cm皿）
細胞培養(yǎng)至密度達80%以上時即可傳代，先將細胞培養(yǎng)基取出3mL用15mL離心管裝好，其他培養(yǎng)基全部吸干舍棄；
培養(yǎng)皿加入2-3mL無菌PBS，輕輕晃動皿，使PBS浸洗到皿底所有部位，PBS吸干舍棄；
加入1mL胰酶，輕輕晃動皿，使胰酶浸沒到皿底所有部位，將皿蓋好放入培養(yǎng)箱中消化；
3min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞不再貼壁，即可加入*步收集的培養(yǎng)基混勻；
若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至不貼壁為止；
將細胞懸液均勻分成幾份，分別加入不同培養(yǎng)皿中，補加新培養(yǎng)基后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
<3>相關(guān)問題
部分細胞在傳代后時，會有以下現(xiàn)象：細胞內(nèi)會有黑色小點、細胞間隙有些顆粒物、培養(yǎng)基漂浮一些死細胞或者細胞長的極慢。出現(xiàn)以上現(xiàn)象時，可以咨詢本公司技術(shù)人員此現(xiàn)象是否正常及相關(guān)處理方式，不要頻繁換液，大多數(shù)細胞1周換液2-3次即可。
細胞碎片較多、背景較臟時，貼壁細胞用PBS漂洗兩次、懸浮細胞打散后低速離心（900rpm，3min）能有效改善。
傳代比例建議1:2-1:3，長得比較快的細胞可以1：3，比較慢的按1:2傳代。傳代后，建議不要使用傳代前培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基，會有大量細胞碎片甚至導(dǎo)致細胞死亡的風(fēng)險。
細胞狀態(tài)不好或者生長極慢的時候，可以通過增加血清濃度調(diào)整細胞狀態(tài)及生長速度。
請不要隨意更換培養(yǎng)基，因?qū)嶒炐枰?，可以逐步馴化。
懸浮傳代：混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗一次。
細胞凍存
<1>凍存操作
凍存液配方：建議使用92%FBS+8%DMSO，客戶自身實驗室所使用的凍存液也可以適用，血清濃度不低于30%，DMSO含量不高于12%即可。
收集細胞按照以上細胞傳代步驟操作至第④步后，將細胞懸液收集入15mL離心管，離心（1200rpm，3min）；
棄上清，加入配制好的凍存液，重懸細胞，懸液加入無菌凍存管中；
將凍存管在4℃靜置10min，后將之正置于室溫下的厚壁有蓋泡沫盒中，蓋緊盒蓋，放入-80℃冰箱過夜，第二天放入液氮即可長期保存。
<2>相關(guān)問題
10cm皿的細胞長滿一般可以凍存2-3管，部分細胞長的比較慢，凍存的細胞密度要稍微大點，以防止復(fù)蘇后生長困難。
凍存液中含的DMSO請使用細胞級DMSO，同時濃度不要太高。部分細胞在10%DMSO條件下凍存會死亡，所以DMSO濃度5%-8%是比較推薦的濃度。
細胞凍存及復(fù)蘇遵循慢凍快融的原則，即凍存時溫度不能急劇下降，應(yīng)控制溫度緩慢下降。復(fù)蘇時應(yīng)快速融化，融化后盡快加入培養(yǎng)基中。
凍存時建議設(shè)置凍存檢測，即取0.2-0.3mL的凍存液重懸的細胞于一個凍存管中，與正常體積凍存的細胞共同凍存，至液氮后復(fù)蘇檢查凍存結(jié)果。凍檢合格前，留一部分細胞繼續(xù)培養(yǎng)，以防萬一。
復(fù)蘇
<1>復(fù)蘇步驟
將凍存細胞從液氮中取出后迅速放入37℃溫水中搖晃融化，時間1min左右；
于1000rpm離心1min，棄凍存液，加入1mL新的*培養(yǎng)基重懸細胞；
接種至新培養(yǎng)瓶或皿中，補加足量*培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
<2>相關(guān)問題
復(fù)蘇過程應(yīng)迅速操作，時間不能太長。
復(fù)蘇過程中注意污染，小心操作。

細胞培養(yǎng)需要耐心與細心，希望您能獲得一個滿意結(jié)果！

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