兔胚胎肢芽間充質(zhì)干原代細(xì)胞

兔胚胎肢芽間充質(zhì)干原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：小鼠原代子宮平滑肌細(xì)胞 細(xì)胞名稱 種屬 人脂肪細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒 人脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠肺動(dòng)脈成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基 100mL 胃粘膜上皮細(xì)胞 大鼠原代腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

實(shí)驗(yàn)室分離的兔胚胎肢芽間充質(zhì)干采用-膠原酶聯(lián)合消化法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實(shí)驗(yàn)室分離的兔胚胎肢芽間充質(zhì)干經(jīng)CD90免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

 

細(xì)胞簡介：

兔胚胎肢芽間充質(zhì)干細(xì)胞分離自胚胎肢芽；胚胎肢芽存在于兩棲類以上的大多數(shù)脊椎動(dòng)物胚胎中，在四肢發(fā)生的初期階段，在身體兩側(cè)有呈芽狀的突起，內(nèi)部是中胚層側(cè)板的體壁板垱厚形成，表面有表皮覆蓋。在這個(gè)中胚層區(qū)肢芽迅速伸長，不久，在其前端即見有指的突起。在此時(shí)期間，其內(nèi)部的中胚層分化成軟骨、肌肉等。這些分化組織，在將肢芽作分離培養(yǎng)的時(shí)候也可以獲得。根據(jù)對(duì)兩棲類的有尾類的研究，作為肢原基各部的胚發(fā)能力，肢芽物質(zhì)的大部分是位于背半部，而前半部主要參與基部形成，后半部參與前端的形成。在實(shí)驗(yàn)上，即使將肢的原基分成二半，每一半調(diào)整好都可形成基本上近于正常形態(tài)的肢體，而且肢體各軸的極性和側(cè)性也逐漸決定。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，是具有高度自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞；這些細(xì)胞可以通過分裂維持自身細(xì)胞的特性和數(shù)量，并在特定條件下轉(zhuǎn)變成為一種或多種構(gòu)成機(jī)體組織或器官的細(xì)胞，從而在組織修復(fù)等方面發(fā)揮積極作用。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣

傳代特性：可傳3-5代左右

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔胚胎肢芽間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長至80%時(shí)取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán)。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。

公司產(chǎn)品：