小鼠附睪上皮原代細胞

小鼠附睪上皮原代細胞

小鼠附睪上皮細胞分離自附睪組織；附睪（Epididymis）是一個由曲折、細小的管子構成的器官，一端接著輸精管（Ductusdeferens），一端接著睪丸（Testis）的曲細精管，具體結構主要包括輸出小管和附睪管。附睪緊貼睪丸的上端和后緣，可分為頭、體、尾三部。離開睪丸后通過輸出小管進入附睪。附睪具有暫存精液并分泌附睪液營養(yǎng)的功能，以促進的進一步成熟附睪的功能是暫存，促進的進一步成熟。在附睪內(nèi)獲得運動能力，總共停留8～17天，終達到功能上的成熟。在這個過程中，除了自身的因素，還受到附睪微環(huán)境的影響，這包括了一系列的物理、化學變化和形態(tài)的改變?？梢哉f，附睪微環(huán)境正常穩(wěn)定是附睪發(fā)揮促成熟這一功能的必要條件。若附睪的功能發(fā)生異常，則不能成熟，引起不育。附睪上皮含有主細胞、基細胞、亮細胞等幾種類型細胞?；毎?，其頂部離附睪管腔有一定距離，在附睪各部分，其形態(tài)沒有差別，一般認為是貯備細胞；另一種主細胞，是維持附睪生理功能的物質(zhì)基礎，在各區(qū)段的主細胞形態(tài)結構差別很大，這也反映出各區(qū)段的生理功能的差異。除上皮細胞外，附睪的管壁組織結構也有規(guī)律性的變化，附睪管起始段平滑肌有自發(fā)地節(jié)律性收縮，而尾部平滑肌就沒有這種特點，僅在射精一瞬間出現(xiàn)強烈的節(jié)律收縮。作為負責提供適合成熟微環(huán)境的附睪，具有活躍的分泌與吸收功能。其中，附睪上皮的電解質(zhì)和水分的轉(zhuǎn)運，對保持附睪內(nèi)合適的離子濃度和酸堿度，為成熟提供適宜的環(huán)境起著相當重要的作用。睪丸的支持細胞每天能產(chǎn)生大量睪網(wǎng)液，如一只公羊每天約能分泌40毫升睪網(wǎng)液，而從附睪排出的只不過幾百微升，也就是說睪丸分泌液有99%被附睪上皮重新吸收回體內(nèi)。動物實驗表明，結扎輸精管時睪丸不會腫脹，但若結扎睪丸輸出小管，睪丸第二天就會腫脹，這就充分證實了附睪存在著強有力的吸收功能，但是重新吸收的意義尚不清楚。體外培養(yǎng)附睪上皮細胞對的發(fā)育、成熟，附睪生理基礎功能研究具有重要意義。

產(chǎn)品名稱：小鼠附睪上皮細胞

組織來源：附睪

產(chǎn)品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基：含FBS、EGF、Hydrocortisone、腎上腺素、甲狀腺素、Insulin、Transferrin、Selenium Solution、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：上皮細胞樣

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

小鼠附睪上皮細胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

方法簡介

實驗室分離的小鼠附睪上皮采用膠原酶消化結合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的小鼠附睪上皮經(jīng)PCK免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。