小鼠腹膜毛細(xì)血管內(nèi)皮原代細(xì)胞

小鼠腹膜毛細(xì)血管內(nèi)皮原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：兔原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 T-47D(人管癌細(xì)胞) HEH2 人胚胎心肌成纖維狀細(xì)胞 1ml/T75 HAN 人羊膜細(xì)胞 NCI-H209 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 人原代牙周膜干細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡介

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠腹膜毛細(xì)血管內(nèi)皮采用膠原酶-蛋白酶聯(lián)合消化法結(jié)合化學(xué)試劑抑制法、并通過內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠腹膜毛細(xì)血管內(nèi)皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

 

細(xì)胞簡介：

小鼠腹膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離自腹膜組織；腹膜是存在于高等脊椎動物腹腔中的一層黏膜，主要由間皮細(xì)胞和間質(zhì)（結(jié)締組織、纖維、毛細(xì)血管、淋巴管）構(gòu)成，藉由結(jié)締組織的支持所形成的一層膜狀組織。腹膜包覆大部分腹腔內(nèi)的器官，能分泌黏液潤濕臟器的表面，減輕臟器間的摩擦。腹腔臟器的血液、淋巴和組織經(jīng)由腹膜與外界相連；腹膜也具有吸收撞擊保護(hù)內(nèi)臟的效果。腹膜（peritoneum）為全身面積大、配布復(fù)雜的漿膜，由皮及少量結(jié)締組織構(gòu)成，薄而光滑，呈半透明狀。襯于腹、盆腔壁內(nèi)表面的腹膜稱為壁腹膜（parietal-peritoneum）或腹壁薄層；覆蓋腹、盆腔器表面的部分稱為臟腹膜（visceral-peritoneum）腹膜或腹膜臟層。臟腹膜與壁腹膜互相延續(xù)、移行，共同圍成不規(guī)則的潛在性腔隙，稱為腹膜腔（peritoneal-cavity）。腹膜腔是臟、壁兩層腹膜之間相互移行圍成的潛在性間隙。腹膜腔內(nèi)有少量漿液，在臟器活動時可減少摩擦。腹膜的主要生理功能：①分泌功能；②吸收功能；③再生能力；④防御功能；⑤調(diào)理功能。臟、壁腹膜都有豐富的毛細(xì)血管，毛細(xì)血管上有不同的孔徑；腹膜的毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后靜脈是進(jìn)行溶質(zhì)交換的主要場所。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

小鼠腹膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán)。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。

公司產(chǎn)品：