1、引物的特異性決定PCR反應特異性。因此引物設(shè)計是否合理對于整個實驗有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。

2、引物設(shè)計原則的把握包括:

1、.引物長度:一般為15～30 bp ，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應的特異性。

2、.堿基分布：四種堿基最好應隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴增的復性溫度一般是較低Tm值減去5～10度。

3、3‘端要求：3’端必須與模板嚴格互補，不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率zui低，G、C居中間，因此引物的3’端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T。

4、引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應存在互補序列，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復性。

5、引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應有多于4個連續(xù)堿基互補，3’端不應超過2個。

6、同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應小于連續(xù)8個的互補堿基存在。

g.5’端無嚴格限制：5’末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進行特異修飾（標記、酶切位點等）等等。

  根據(jù)實驗目的選擇適當?shù)囊?。常用引物設(shè)計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設(shè)置。