PCR引物設(shè)計需要注意：

1、引物長度：一般為15～30個堿基，引物太短會降低擴(kuò)增特異性。引物過長退火溫度會提高，不利于反應(yīng)的發(fā)生。

2、引物序列：設(shè)計引物時堿基要隨機(jī)分布，避免堿基或核苷酸的重復(fù)導(dǎo)致錯誤引發(fā)；引物間和引物自身序列也要盡量避免互補(bǔ)，防止形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

3、堿基分布：GC含量一般40-60%，含量過高或過低都不利于進(jìn)行反應(yīng)。其含量過低會使引物不穩(wěn)定；過高會引發(fā)非特異性擴(kuò)增。

4、 Tm值：引物的Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）+2（A+T），盡可能保證上下游引物的Tm值一致，一般不超過2℃。

5、 引物設(shè)計好后進(jìn)行BLAST檢查，檢測是否與基因組中重復(fù)序列或其它基因位點有交叉同源；

6、 引物的特異性：引物的3'端如果含有一個G或C殘基能增加引物的特異性。